趙玉升，李偉洋，曹天佑，陳玉民，白 雪，張 盈，吳 同，屈會化，趙 琰*

1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029

2.漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南 漯河 462002

3.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029

4.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，北京 100029

葶藶子系十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿Descurainia sophia(L.) Webb.ex Prantl.或獨行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子。性辛、苦，大寒。歸肺、膀胱經(jīng)，具有瀉肺平喘、利水消腫之功效[1]?！秱s病論》中更是將葶藶子用于治療肺癰、結(jié)胸、支飲等肺系疾病。

碳量子點是一類新興的以碳為骨架的納米材料，具有光穩(wěn)定性好、毒性小、生物相容性好、水分散性好等優(yōu)點[2-3]。由于這些優(yōu)勢，碳量子點在生物成像[4]、藥物傳遞[5]、納米醫(yī)學[6]等多個領域引起了廣泛關注。值得注意的是，由于碳量子點具有顯著的優(yōu)勢，其相關應用開發(fā)為發(fā)現(xiàn)有效控制或治療某些疾病的新一代藥物提供了許多策略。碳量子點的相關生物活性如止血[7]、抗炎[8]、抗菌[9]和抗腫瘤[10]等已經(jīng)得到廣泛研究，引起了國內(nèi)外科學家的廣泛關注，以期研究碳量子點的其他醫(yī)藥和生物醫(yī)學應用。

本研究從納米材料學角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)葶藶子經(jīng)過高溫炮制后產(chǎn)生了一種新的物質(zhì)，將其命名為葶藶子炭納米類成分（Descurainiae Semen Carbonisatumnano-components，DSC-NCs），利用低分辨透射電鏡（TEM）、高分辨透射電鏡（HR-TEM）和X射線衍射儀（XRD）對DSC-NCs的微觀結(jié)構進行表征，進一步利用HPLC排除小分子存在的干擾性，利用紫外光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）等方法來獲取DSC-NCs的化學基團信息。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)該成分符合納米材料中碳量子點的基本特征，且有報道表明碳量子點治療急性肺損傷（acute lung injury，ALI）具有廣泛的應用前景。因此，本研究利用脂多糖誘導大鼠ALI，探究DSCNCs對ALI的保護作用及其保護機制，以期為臨床治療ALI提供新的藥物和策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PXR-9馬弗爐，北京中科澳博科技股份有限公司；JEN-1230高分辨透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；F-4500熒光分光光度計，日本Hitachi公司；D8-Advanced X射線衍射儀，德國Bruker AXS公司；CECIL紫外分光光度計，英國Cambridge公司；Agilent 1260系列高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；TecnaiG220透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；JEN-1230傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀和Escalab 250Xi X射線光電子能譜分析儀，美國Thermo公司。

1.2 藥品和試劑

葶藶子，產(chǎn)地河北，批號200723002，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學趙琰教授鑒定，為十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿D.sophia(L.) Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，采購于北京仟草中藥飲片有限公司；地塞米松，規(guī)格0.75 mg/片，批號H33020822，購于浙江仙琚制藥股份有限公司；脂多糖與10%組織固定液購于北京拜爾迪生物技術有限公司；相對分子質(zhì)量（Mw）1000透析膜購于北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購于武漢云克隆科技股份有限公司；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛試劑盒等均購買于南京建成生物工程研究所；乙醇和其他分析級化學試劑均購于北京化學試劑公司；雙蒸水與蒸餾水購買于北京拜爾迪生物技術有限公司，去離子水由北京中醫(yī)藥大學科研逸夫樓提供。

1.3 動物和細胞

SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（200.0±10.0）g，質(zhì)量合格證編號為110324201102996362。實驗動物均購于北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司。實驗環(huán)境為北京中醫(yī)藥大學西校區(qū)動物房屏障系統(tǒng)，保持室溫（24.0±1.0）℃，相對濕度55%～65%，12 h明暗交替，通風良好，飼養(yǎng)期間內(nèi)自由進水、進食，實驗前12 h小鼠禁食不禁水。本實驗相關動物實驗遵循北京中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。人肺泡腺癌基底上皮A549細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSC-NCs的制備

稱取葶藶子干燥藥材480 g，放于坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第1階段5 min升溫至70 ℃，保溫25 min；第2階段25 min升溫至350 ℃，保溫1 h。將燒制好的葶藶子炭置于中藥粉碎機中粉碎。稱取炭粉末100 g，加入1800 mL去離子水中煎煮3次，溫度為100 ℃，時間為1 h。然后使用0.22 μm微孔濾膜將煎煮液進行濾過，合并3次濾液，濃縮并選用Mw1000的透析膜透析7 d，烘干后獲取粉末20 mg，于4 ℃保存，留置待用。

2.2 HPLC分析

利用HPLC比較所獲得的DSC-NCs和葶藶子生藥在成分上的區(qū)別。稱取葶藶子生藥2 g，加入40 mL甲醇超聲處理30 min，獲得甲醇提取液。將上述制備的DSC-NCs用水稀釋至2 g/mL（按炭藥量計算），獲得DSC-NCs稀釋液。所有樣品使用0.22 μm微孔濾膜濾過后再進樣。

色譜條件[11]：高效液相色譜儀采用四元泵-二極管陣列檢測器，自動進樣器；色譜柱為Reliasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為1%磷酸水溶液-乙腈，等度洗脫程序：0～12 min，10%乙腈；12～18 min，10%～14%乙腈；18～30 min，14%～19%乙腈；30～35 min，19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%乙腈；進樣量10.0 μL；體積流量為1 mL/min；檢測波長設定為330 nm；柱溫30 ℃。

經(jīng)過高溫炭化、煎煮、濾過、濃縮、透析后獲得DSC-NCs溶液，利用HPLC比較350 ℃下制備的DSC-NCs溶液和葶藶子生藥乙醇提取液的成分差異。如圖1所示，葶藶子乙醇提取液中可以觀察到一系列峰，說明含有苷類化合物等小分子化合物。而與之形成鮮明對比的是，經(jīng)過透析后的DSC-NCs溶液中觀察不到小分子的存在，說明DSC-NCs溶液在經(jīng)過透析過程后的小分子成分已經(jīng)不存在了。經(jīng)過HPLC的觀察對比，在一定程度上排除了小分子化合物的干擾。

圖1 葶藶子 (a) 和DSC-NCs (b) 的HPLC圖Fig.1 HPLC profile of Descurainiae Semen (a) and DSCNCs (b)

2.3 DSC-NCs的表征

利用TEM、HR-TEM和XRD來獲取DSC-NCs的形貌大小、粒徑分布和晶格間距等微觀結(jié)構信息；利用紫外光譜和熒光光譜來獲取DSC-NCs的光學特征信息；利用FTIR來獲取DSC-NCs表面的官能團信息；利用XPS來分析DSC-NCs中所含有元素及其可能連接方式。

圖2-a為DSC-NCs低分辨電鏡表征結(jié)果，可以看出，DSC-NCs外觀形貌近球形，用Image J軟件對200個顆粒進行統(tǒng)計分析，結(jié)果為該納米類成分的粒徑分布在2.5～6.5 nm，符合正態(tài)分布。圖2-c為DSC-NCs的高分辨透射電鏡表征結(jié)果，DSC-NCs晶格分布明顯，晶格間距為0.224 nm。利用XRD進一步分析DSC-NCs內(nèi)部原子在空間分布的狀態(tài)，從圖2-d中可以觀察到1個典型的非晶體衍射峰，這與自下而上法傾向于產(chǎn)生含無定形碳核的納米類成分有關[15]。

圖2 DSC-NCs的表征組圖Fig.2 Characterization of DSC-NCs

DSC-NCs的紫外光譜如圖2-e所示，DSC-NCs在260～280 nm處可以觀察到有一處微弱的吸收峰，這可能是由于含有雜原子的不飽和基團引起的n-π*躍遷所導致[16]。DSC-NCs的熒光光譜分析結(jié)果如圖2-f所示，DSC-NCs的最大激發(fā)波長為388 nm，最大發(fā)射波長為453 nm。

DSC-NCs紅外光譜結(jié)果如圖2-g所示，在3426、2922、1634、1034 cm-1處出現(xiàn)了特征峰，其中3426 cm-1的吸收峰提示可能存在-O-H鍵，2922 cm-1處的吸收峰提示為-CH2-的伸縮振動峰，這是亞甲基的特征峰，1634 cm-1的強吸收峰為-C＝O鍵的伸縮振動峰，1384 cm-1的強而尖銳的吸收峰提示可能為-OH的面內(nèi)彎曲振動峰，1034 cm-1處的吸收峰提示可能含有-C-O-C-鍵。這表明經(jīng)過炭化產(chǎn)生的DSC-NCs表面存在羥基、羧基和氨基等功能基團[17]。

通過XPS對DSC-NCs的元素組成和基團連接方式進行了表征。具體測定結(jié)果如圖3所示，圖3-a中284.85、399.99、531.98 eV的位置有明顯的峰，表明DSC-NCs主要由C（72.84%）、O（22.3%）元素和少量的N（4.86%）元素共同組成，從圖中峰值可以看出，C和O的元素含量最多，高達95.14%。在DSC-NCs高分辨XPS圖譜中，圖3-b C1s譜帶中，顯示出284.71、285.77、288.23 eV 3個峰，與之相對應的鍵分別是C-N、C＝O、C-O。在圖3-c的N1s譜帶中，顯示出399.62、400.32 eV 2個峰，與之相對應的鍵分別是C-N、N-H。在圖3-d的O1s譜帶中，顯示出531.51、532.85 eV 2個峰，與之相對應的鍵分別是C-O、C＝O[18]。

圖3 利用XPS分析技術對DSC-NCs的表面基團和元素組成信息進行分析Fig.3 Surface composition and elemental analysis of DSC-NCs by XPS

從以上圖譜特征數(shù)據(jù)的結(jié)果來看，分析解讀了DSC-NCs的主要元素組成和含量，得知其配位情況，證實了DSC-NCs除了C、O元素外，還被N與其他元素少量摻雜，并且推測有多種官能集團共同存在于DSC-NCs的表面。

2.4 熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield，F(xiàn)QY）測定

FQY也稱熒光量子效率，它是表示一種物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)[12]。本實驗中測定的結(jié)果為DSCNCs的相對FQY，參比物質(zhì)選擇硫酸奎寧。熒光光譜掃描時激發(fā)波長與發(fā)射波長的狹縫寬度皆為10 nm。根據(jù)公式FQYNCs＝FQYRINCsARηNCs2/(IRANCsηR2)對DSC-NCs的FQY進行計算，公式中I為發(fā)射光譜下的峰面積，A為365 nm時的吸光度值，η為溶劑的折射率，下標NCs和R代表DSC-NCs和參照物。為了使重吸收效應最小化，AR和ANCs的吸光度值應該保證在0.05以下[13]。以硫酸奎寧作為標準物進行DSC-NCs的熒光量子產(chǎn)率測，最終計算得出DSC-NCs的熒光量子產(chǎn)率為17.31%。

2.5 CCK-8實驗

2.5.1 實驗設計 安全性是其生物應用過程中需要考慮的問題之一，本實驗以人肺癌A549細胞為研究對象，利用CCK-8實驗來評價DSC-NCs對A549細胞的毒性大小[14]。將培養(yǎng)好的A549細胞懸液稀釋至1×105個/mL，置于96孔板上。在四周邊緣緩慢加入PBS緩沖液（100 μL/mL），將其放入CO2細胞培養(yǎng)箱進行孵育，條件設置為5% CO2、37 ℃，時間為24 h。之后棄去上清液，在對照組加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基，在給藥組依次加入已配制好的8種不同質(zhì)量濃度（1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81 μg/mL）的DSC-NCs溶液，每孔100 μL，再次放入CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。取出上述96孔細胞培養(yǎng)板，加入CCK-8試劑（10μL/孔），繼而放入CO2培養(yǎng)箱，4 h后取出。將其放于酶標儀中進行檢測，波長450 nm，記錄吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(Ae－Ab)/(Ac－Ab)

Ae為給藥組的吸光度，Ac為對照組吸光度，Ab為空白組吸光度

2.5.2 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以表示。統(tǒng)計學處理采用方差分析。單因素 ANOVA分析方法用于實驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，同時方差齊。組間差異則運用LSD方法統(tǒng)計。

2.5.3 實驗結(jié)果 結(jié)果如表1所示，當DSC-NCs的質(zhì)量濃度為500.00 μg/mL和7.81 μg/mL時，其細胞存活率和對照組近似。當DSC-NCs的質(zhì)量濃度大于500.00 μg/mL時，細胞存活率降低，說明DSCNCs在給藥質(zhì)量濃度高于500.00 μg/mL對A549細胞存在一定的毒性。當DSC-NCs的質(zhì)量濃度在7.81～500.00 μg/mL，對A549細胞具有一定的促進增殖作用，而質(zhì)量濃度在7.81～125.00 μg/mL，隨著DSC-NCs質(zhì)量濃度的升高，增殖作用逐漸增強，質(zhì)量濃度在125.00 μg/mL時，增殖作用達到最強，其后在125.00～500.00 μg/mL，隨著質(zhì)量濃度的升高，增殖作用反而逐漸降低。以上實驗結(jié)果為今后DSC-NCs在臨床上的應用劑量提供了一定的參考。

表1 不同質(zhì)量濃度的DSC-NCs對A549細胞存活率的影響 ( , n = 6)Table 1 Effect of different concentrations of DSC-NCs on viability of A549 cells ( , n = 6)

表1 不同質(zhì)量濃度的DSC-NCs對A549細胞存活率的影響 ( , n = 6)Table 1 Effect of different concentrations of DSC-NCs on viability of A549 cells ( , n = 6)

組別 劑量/(μg·mL-1) 細胞存活率/%對照 - 100.00±10.37 DSC-NCs 1 000.00 53.97±3.29 500.00 103.57±7.21 250.00 130.95±11.14 125.00 144.58±7.58 62.50 133.99±11.85 31.25 112.64±7.20 15.63 118.39±9.50 7.81 100.33±7.34

2.6 DSC-NCs對脂多糖致大鼠ALI的作用研究

2.6.1 實驗分組、給藥和造模 將48只SD大鼠，隨機分為6組，每組8只，分別為對照組、模型組、陽性對照組（地塞米松，5 mg/kg）和DSC-NCs高劑量組（3.33 mg/kg）、中劑量組（1.67 mg/kg）、低劑量組（0.84 mg/kg）。適應飼養(yǎng)環(huán)境后，DSC-NCs高、中、低劑量組連續(xù)10 d ip給藥，其他組均ip相同體積的生理鹽水。陽性對照組在造模前1 h ip地塞米松溶液，1 h后，除對照組ip等體積生理鹽水外，其余各組均ip制備的脂多糖溶液（5 mg/kg）進行造模。

2.6.2 病理切片觀察 造模8 h后，用4%水合氯醛（0.40 g/kg）麻醉大鼠后進行解剖，將大鼠左肺組織取出置于10%組織固定液中固定48 h以上，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅（H&E）染色。比較對照組，模型組，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組肺部的形態(tài)學變化。各組肺組織的病理形態(tài)結(jié)果如圖4所示，圖4-a顯示對照組的肺組織結(jié)構正常，肺泡的形態(tài)完整，肺間質(zhì)結(jié)構清晰，肺泡內(nèi)無炎性細胞浸潤；與對照組比較，模型組的肺組織結(jié)構破壞較為嚴重，明顯可見肺泡壁增厚、肺間質(zhì)充血，肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤（圖4-b）；與模型組比較，地塞米松組中肺泡形態(tài)較為完整，肺泡腔及肺間質(zhì)炎性細胞浸潤狀態(tài)較模型組明顯減輕（圖4-c）；與模型組比較，給予不同劑量的DSC-NCs治療后，肺組織破壞程度、炎性細胞浸潤和充血程度得到有效的緩解和不同程度的改善（圖4-d～f），其中高劑量組的效果最為明顯，具有一定的量效關系。

圖4 DSC-NCs對LPS致大鼠ALI肺組織病理改變的影響 (×50)Fig.4 Effect of DSC-NCs on pathological changes of lung tissue in rats with ALI induced by LPS (× 50)

2.6.3 血清中細胞因子水平 造模8 h后，用4%水合氯醛（0.40 g/kg）麻醉大鼠。使用采血針和真空采血管，經(jīng)腹主動脈采集大鼠血液。將采集好的大鼠血液置于室溫環(huán)境下，靜置60 min，然后放入高速冰凍離心機中以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，獲取上清液，于-80 ℃保存，留置待用。按照試劑盒的指導說明進行操作，分別測定血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。IL-6、IL-1β和TNF-α是急性炎癥的重要炎癥因子，各組大鼠血清中IL-1β的含量比較如表2所示，與對照組比較，模型組血清中IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比較，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均可以明顯降低大鼠血清中IL-1β的水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其中DSC-NCs高劑量組低于地塞米松組，說明DSC-NCs高劑量組的治療作用較強于陽性藥。而隨著DSC-NCs的劑量降低，血清中IL-1β水平升高，存在明顯量效差異。DSC-NCs對大鼠血清中IL-6的含量與IL-1β類似，與對照組相比，模型組血清中IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低血清中IL-6水平（P＜0.01），其中以地塞米松組和DSC-NCs高劑量組的治療效果較優(yōu)。

表2 DSC-NCs對LPS致大鼠ALI血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ( , n = 8)Table 2 Effect of DSC-NCs on IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats with acute lung injury induced by LPS (,n = 8)

表2 DSC-NCs對LPS致大鼠ALI血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ( , n = 8)Table 2 Effect of DSC-NCs on IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats with acute lung injury induced by LPS (,n = 8)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(mg·kg-1)IL-1β/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)TNF-α/(pg·mL-1)對照 - 4.35±0.58 2.94±0.62 23.17±1.31模型 5 21.07±2.26## 20.29±1.27## 66.61±8.26##地塞米松 5 9.49±0.86** 6.30±1.06** 27.39±2.70**DSC-NCs 3.33 8.98±1.31** 8.75±1.15** 28.14±5.17**1.67 11.57±1.21** 13.98±1.36** 29.24±4.57**0.84 16.81±0.53** 14.47±1.26** 29.39±5.85**

各組大鼠血清中TNF-α的含量比較如表2所示，與對照組相比，模型組血清中TNF-α水平明顯升高，具有顯著的差異性（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清TNF-α水平（P＜0.01），4者之間的差異并不明顯。

綜上所述，DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，表明DSC-NCs能夠抑制炎癥細胞因子的分泌，而起到減輕肺損傷的作用。

2.6.4 抗氧化水平 取出小鼠的右肺，用濾紙將分離出的肺組織水分吸干，取一部分后使用電子天平進行精確稱定，將稱好的肺組織放入10 mL EP管中，按照質(zhì)量體積比為1∶9加入生理鹽水制備成10%的組織勻漿，然后加入研磨球，使用冷凍混合球磨儀進行研磨，最后使用高速冷凍離心機（3000 r/min，10 min）進行離心，獲取肺組織勻漿上清液，按照試劑盒的說明，測定SOD活性和丙二醛的水平。

氧化應激是ALI炎癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，通過進一步評估SOD活性和丙二醛的水平來表征氧化還原狀態(tài)的變化。各組肺組織中SOD活性比較如表3所示，與對照組相比，模型組中SOD的活性明顯降低（P＜0.01），說明脂多糖誘導的ALI大鼠的肺組織發(fā)生了嚴重的氧化損傷。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高劑量組均能明顯升高肺組織中SOD的活性（P＜0.01），明顯提高了機體的抗氧化能力，DSC-NCs中劑量組也能提高肺組織中SOD的活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而DSC-NCs低劑量組與模型組比較沒有明顯差異。

各組肺組織中的丙二醛水平比較如表3所示，與對照組相比，模型組肺組織中丙二醛含量明顯升高，說明肺組織受損嚴重。與模型組相比，地塞米松組和DSC-NCs高、中、低劑量組肺組織中丙二醛的含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上實驗結(jié)果表明，DSC-NCs能夠通過提高抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生來減輕過度氧化應激對肺臟的損傷作用。

表3 DSC-NCs對LPS致大鼠ALI肺組織中SOD活性和MDA水平的影響 ( , n = 8)Table 3 Effect of DSC-NCs on SOD activity and level of MDA in lung tissue of rats with ALI induced by LPS ( ,n = 8)

表3 DSC-NCs對LPS致大鼠ALI肺組織中SOD活性和MDA水平的影響 ( , n = 8)Table 3 Effect of DSC-NCs on SOD activity and level of MDA in lung tissue of rats with ALI induced by LPS ( ,n = 8)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(mg·kg-1) SOD/(U·mg-1) MDA/(nmol·mg-1)對照 - 149.33±18.32 3.83±0.14模型 5 71.98±9.15## 6.39±0.12##地塞米松 5 139.33±11.61** 4.59±0.27**DSC-NCs 3.33 128.83±9.37** 4.81±0.75**1.67 95.21±11.72* 4.95±0.61**0.84 85.16±29.71 5.17±0.63**

3 討論

本實驗通過一系列成熟的制備工藝來獲取葶藶子炭化物純化后的透析液，經(jīng)TEM、HR-TEM、熒光光譜、FTIR、XPS等儀器鑒定并命名為DSC-NCs。DSC-NCs外觀形貌近球形，分散度良好，粒徑大小均一，主要集中在2.5～6.5 nm，晶格間距為0.224 nm。XPS分析顯示DSC-NCs中含有C、O、N等元素，其中C、O元素占主導地位，結(jié)合紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)葶藶子炭納米類成分表面官能團豐富，含有大量的羥基、羧基等基團。

經(jīng)過HPLC的觀察對比，經(jīng)過透析后的DSCNCs溶液中觀察不到小分子的存在，在一定程度上排除了小分子化合物的干擾。此外，本實驗利用CCK-8法測定了DSC-NCs的安全性范圍在500 μg/mL以內(nèi)，生物安全性高。

ALI是一系列炎癥反應和繼發(fā)性彌漫性肺實質(zhì)損傷，涉及多種炎癥介質(zhì)和效應細胞，其發(fā)病原因多樣，其中由脂多糖引起的占大多數(shù)，可引起炎癥反應和氧化應激導致肺損傷，是用于評價藥物對ALI作用的經(jīng)典模型[19]。從本實驗的肺組織切片來看，模型大鼠在給予不同劑量的DSC-NCs治療后，肺組織破壞程度和炎性細胞浸潤狀態(tài)得到有效的緩解和不同程度的改善，說明DSC-NCs具有治療ALI的作用。

在ALI的形成過程中涉及到多方面的作用結(jié)果，單核-巨噬細胞和嗜中性粒細胞在受到外界刺激后聚集到肺泡腔，產(chǎn)生大量細胞因子，傳遞炎癥信號，通過級聯(lián)放大反應促進炎癥的發(fā)展，導致肺部損傷[20]。TNF-α是最早參與ALI發(fā)病過程的炎癥因子，主要是由LPS刺激肺泡-巨噬細胞后生成，除了直接破壞內(nèi)皮細胞，還能刺激鄰近細胞釋放更多的炎癥因子，進而介導中性粒細胞和巨噬細胞的招募[21]。此外，TNF-α還能誘導免疫細胞轉(zhuǎn)移、增加血管通透性以及影響肺水腫的形成，導致低氧血癥，從而進一步加重肺損傷。IL-1β是固有免疫和炎性反應的主要調(diào)節(jié)因子，誘導中性粒細胞迅速聚集到肺部，引起炎癥介質(zhì)釋放，加重炎癥損傷，因此IL-1β的表達水平也是反映ALI嚴重程度的經(jīng)典指標[22]。IL-6主要來源于單核-巨噬細胞，其能促進炎癥發(fā)展，影響巨噬細胞的生長和分化，大量的IL-6還會促進血管活性物質(zhì)和中性粒細胞的釋放，脂多糖作用于機體后，能夠檢測到IL-6的水平有所升高，是檢測ALI的指標之一[23]。本實驗研究結(jié)果顯示，DSC-NCs高、中、低劑量組均能明顯降低大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，表明DSC- NCs能夠在一定程度上抑制炎癥細胞因子的分泌，從而起到減輕肺損傷的作用。

大量研究[24]表明，氧化應激損傷是ALI發(fā)病的重要機制，能夠使細胞內(nèi)活性氧顯著增加，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，就會不斷大量形成新的自由基，造成肺組織損傷。SOD是一種重要的抗氧化酶，對機體的氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡起重要作用，其活性高低反映了機體抗氧化能力的大小[25]。過量的活性氧會誘導脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生丙二醛，因而能夠作為反映脂質(zhì)過氧化嚴重程度的標志物[26]。相關研究[27]表明葶藶子生藥能有效改善ALI引起的肺淤血、肺水腫以及炎細胞浸潤程度，其機制可能與發(fā)揮藥效的小分子物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)水通道蛋白5的含量有關；本實驗證明了從葶藶子炭中提取分離的DSC-NCs也能有效緩解ALI大鼠肺泡腔及肺間質(zhì)中的炎性細胞浸潤程度，改善肺水腫，尤其以高劑量組的作用更顯著，其機制可能與升高SOD的活性、減少丙二醛的含量有關，能夠通過提高抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生來減輕過度氧化應激對肺臟的損傷作用。但本實驗尚未從相關信號通路的水平上去研究DSC-NCs發(fā)揮藥效的內(nèi)在機制，仍是今后重點研究的方向之一。因此，本實驗中DSC-NCs的發(fā)現(xiàn)及其治療脂多糖致ALI的證明，不僅為葶藶子炭的活性成分提供了一個新的研究方向，也為DSC-NCs作為一種治療ALI的新型藥物研發(fā)奠定了堅實的實驗基礎。

本實驗利用高溫熱解法成功從葶藶子炭中提取分離出新型納米類成分DSC-NCs。在脂多糖致大鼠ALI模型中，表面攜帶豐富基團的DSC-NCs起到了明顯的保護作用，其發(fā)揮作用的機制初步證明是與減少IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥細胞因子水平有關，也可以在一定程度上減少肺部的炎癥，增強機體的抗氧化活性。本研究為DSC-NCs在臨床抗肺炎中的應用提供了重要依據(jù)，為DSC-NCs的研發(fā)奠定了實驗基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突