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        ‘由良’蜜橘成年態(tài)莖段培養(yǎng)及微芽嫁接方法的優(yōu)化*

        2021-10-25 08:30:42譚李梅駱夏輝唐志敏蔡建國(guó)
        中國(guó)果樹(shù) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:莖段種皮無(wú)菌

        徐 嚴(yán),譚李梅,駱夏輝,楊 亞,唐志敏,周 閏,蔡建國(guó)

        (郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院郴州分院,423000)

        ‘由良’蜜橘為日本選育的品種,系‘宮川’特早熟芽變,2006 年引入國(guó)內(nèi)試驗(yàn)研究[1],在浙江省永嘉、寧海等地栽培表現(xiàn)良好,極具發(fā)展前景[2-3]。湖南省郴州市“東江湖蜜橘”為地理標(biāo)志產(chǎn)品,是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民致富的支柱產(chǎn)業(yè)之一[4]。東江湖蜜橘主栽柑橘品種為‘宮川’,由于品種老化等問(wèn)題導(dǎo)致效益降低,引進(jìn)特早熟‘由良’蜜橘是提高“東江湖蜜橘”品質(zhì)的有效途徑。

        長(zhǎng)期無(wú)性繁殖及頻繁的區(qū)域調(diào)運(yùn)苗木使柑橘易感染病毒和類(lèi)病毒病害,對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失且尚無(wú)有效的防治藥劑。近年來(lái),柑橘黃龍病的蔓延十分嚴(yán)重,培育和栽植無(wú)病毒苗木是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一。珠心苗培育和莖尖培養(yǎng)存在童期長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題,且柑橘成年態(tài)植株的莖尖難以直接誘導(dǎo)分化成完整植株。Murashige提出莖尖微芽嫁接技術(shù),并證實(shí)可脫除柑橘病毒病。研究表明[5-6],莖尖嫁接技術(shù)是目前脫除柑橘病毒和類(lèi)病毒最有效的方法,可成功脫除黃龍病、衰退病、裂皮病等多種病害。

        從田間直接采取柑橘莖尖受季節(jié)影響較大,莖段組織培養(yǎng)是獲得莖尖的重要途徑之一,但柑橘成年態(tài)莖段組培過(guò)程中污染率高、芽體增殖分化低等問(wèn)題制約了相關(guān)技術(shù)的發(fā)展[7]。優(yōu)化柑橘成年態(tài)莖段消毒和培養(yǎng)方法,對(duì)提高莖尖嫁接脫毒效率,為柑橘無(wú)病毒苗木繁育提供技術(shù)支撐具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)所用的外植體采自郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所果樹(shù)基地柑橘園,供試品種‘由良’蜜橘,砧木為枳,樹(shù)齡3 年。莖尖微芽嫁接的砧木種子為保存在實(shí)驗(yàn)室的‘卡里佐’枳橙種子。

        1.2 試驗(yàn)處理與方法

        1.2.1 砧木種子處理和試管砧木培養(yǎng)

        挑選飽滿(mǎn)、無(wú)傷痕的種子,在室內(nèi)用無(wú)菌水沖洗干凈后,剝?nèi)ネ夥N皮并保濕,將種子倒入滅菌培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺(tái)上加入75%酒精消毒30 s,再用1%NaClO 和吐溫20 消毒20 min,然后用無(wú)菌水沖洗種子3 次。用3 種方式進(jìn)行種子處理:剝除內(nèi)種皮、劃破內(nèi)種皮、直接播種。處理完成后,用鑷子輕輕夾住種子并送入裝有MS 固體培養(yǎng)基的試管里,每管1~2 粒種子,放入27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),14 d 后統(tǒng)計(jì)種子污染率和萌芽率。砧木長(zhǎng)到10~15 cm 時(shí),放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 外植體采集

        (1)單芽莖段的采集。2020 年6 月5 日(晴天)10:00,剪取無(wú)病蟲(chóng)害、半木質(zhì)化枝條,裝入潔凈的塑料袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,將枝條上的葉片剪去,自來(lái)水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h,再?zèng)_洗20 min,剪成2 cm 左右的單芽莖段,放入干凈的培養(yǎng)瓶中用無(wú)菌水浸泡保濕。

        (2)多芽莖段的采集。于6 月15 日(晴天)10:00,從培養(yǎng)室內(nèi)剪取1 年生的無(wú)病蟲(chóng)害、半木質(zhì)化枝條,裝入潔凈的塑料袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,將枝條上的葉片剪去,自來(lái)水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h,再?zèng)_洗20 min,剪成帶有3 個(gè)腋芽的莖段,放入干凈的培養(yǎng)瓶中用無(wú)菌水浸泡保濕。

        (3)直接采取莖尖。于6 月25 日(晴天)10:00,采取長(zhǎng)2~3 cm 的嫩芽(帶2~3 片嫩葉),用濕潤(rùn)棉花進(jìn)行保濕后帶回實(shí)驗(yàn)室,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)去除嫩葉,放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用無(wú)菌水保濕。

        1.2.3 外植體消毒和培養(yǎng)

        (1)單芽莖段的消毒。采用5 種方法對(duì)柑橘單芽莖段進(jìn)行消毒處理,即方法A:采用1%NaClO消毒20 min→無(wú)菌水沖洗5 次;方法B:采用3%NaClO 消毒20 min→無(wú)菌水沖洗5 次;方法C:采用5%NaClO 消毒20 min→無(wú)菌水沖洗5 次;方法D:采用1%NaClO 消毒20 min→無(wú)菌水沖洗5次;方法E:用1%NaClO 消毒25 min→無(wú)菌水沖洗5 次。每種方法均先用75%酒精處理30 s,其中方法A、B、C 從田間采樣,方法D、E 從培養(yǎng)室采樣。

        (2)多芽莖段的消毒。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s,經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗后,放入1%NaClO 中消毒20 min,最后用無(wú)菌水沖洗3~5 次。

        (3)田間采集的莖尖消毒。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s,經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗后,放入0.3%NaClO 中消毒5 min,最后用無(wú)菌水沖洗3~5 次。

        莖段消毒后放入MS 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基添加30.0 g/L 蔗糖和7.5 g/L 瓊脂。培養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,光暗周期16 h/8 h。每處理3 次重復(fù),培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計(jì)萌芽率、污染率等。

        1.2.4 單芽莖段離體培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

        不同單芽莖段的培養(yǎng)基均以MS 為基本培養(yǎng)基,附加6-BA(濃度0.5、1.0、1.5 mg/L)和IBA(濃度0、0.05、0.1 mg/L)的不同濃度組合,每個(gè)濃度組合培養(yǎng)20 個(gè)單芽莖段,重復(fù)3 次。30 d 后觀察記載萌芽數(shù)量。培養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,光暗周期16 h/8 h。

        1.2.5 莖尖微芽嫁接及培養(yǎng)

        在解剖鏡下剝?nèi)『?~4 個(gè)葉原基的莖尖嫁接于試管砧木苗上,放入MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,光暗周期16 h/8 h,光照強(qiáng)度為1 000~2 000 lx。每處理3 次重復(fù),培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計(jì)腋芽數(shù)、出芽數(shù)、可用芽數(shù),計(jì)算增殖倍數(shù)和利用率。

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 和SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同處理方式試管播種對(duì)砧木種子萌發(fā)的影響

        由表1 可知,內(nèi)種皮不同處理間的污染率具有顯著性差異,內(nèi)種皮剝除面積越大種子污染率越高,其中直接播種的污染率為17.5%,劃破內(nèi)種皮的污染率為32.5%,剝除內(nèi)種皮的污染率達(dá)75.0%。剝除內(nèi)種皮和劃破內(nèi)種皮的萌芽率均顯著高于直接播種,為60.0%,直接播種的萌芽率僅為32.5%。由于最終目的是獲得無(wú)污染的萌芽種子,故劃破內(nèi)種皮是砧木種子試管播種處理的理想方式。

        表1 不同處理方式對(duì)砧木種子在14 d 萌發(fā)的影響

        2.2 成年態(tài)莖段消毒方法的篩選

        由表2 可知,不同消毒試劑、消毒時(shí)間及采樣地點(diǎn)對(duì)‘由良’蜜橘成年態(tài)莖段的消毒效果均有影響。從田間采集的外植體中,NaClO 的濃度越高污染率越低,褐化率越高,且均具有顯著差異。其中,1%NaClO 的污染率最高,為35.0%,褐化率最低,為45.0%;5%NaClO 的污染率最低,為5.0%,褐化率最高,為90.0%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),成活的成年態(tài)莖段初期均可萌芽,但由于污染和褐化等原因?qū)е潞笃跓o(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng),隨著NaClO 濃度的升高萌芽率隨之降低,其中1%NaClO 的萌芽率最高,為20.0%。

        表2 不同消毒方法對(duì)‘由良’蜜橘成年態(tài)單芽莖段消毒效果的影響

        為了提高消毒效果,增加萌芽率,將試材從田間轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室培養(yǎng),在培養(yǎng)室中抽梢,保持干凈的培養(yǎng)環(huán)境,避免枝條感染過(guò)多真菌或細(xì)菌。試驗(yàn)結(jié)果表明,從培養(yǎng)室采集的成年態(tài)莖段用1%NaClO消毒時(shí)間為20 min 和25 min 的污染率一樣,但褐化率降低。消毒20 min 的萌芽率達(dá)到70.0%,比從田間采樣高50 個(gè)百分點(diǎn),差異達(dá)顯著水平(表2)。

        綜上所述,NaClO 濃度越高莖段污染率越低,褐化率越高,萌芽率越低,且從培養(yǎng)室采集的莖段污染率、褐化率都顯著低于田間采集的,萌芽率顯著高于田間采集的,即從培養(yǎng)室采集的成年態(tài)莖段用1%NaClO 消毒20 min 的消毒效果最好,污染率為20.0%,褐化率為10.0%,萌芽率達(dá)70.0%(表2)。

        2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)莖段離體培養(yǎng)的影響

        為了獲得更多的莖尖數(shù)量,提高‘由良’蜜橘脫毒效率,以MS 為基本培養(yǎng)基,添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比,分析不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)單芽莖段的效果,并同時(shí)觀察不同培養(yǎng)基條件下莖尖數(shù)量是否有差異。由表3 可以看出,6-BA 為0.5 mg/L、IBA 為0 時(shí)萌芽率最高,達(dá)95.5%,但增殖倍數(shù)最低;6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時(shí)萌芽率次之,為91.6%,但增殖倍數(shù)最大,達(dá)3.0。綜合來(lái)看,6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時(shí),對(duì)‘由良’單芽莖段離體培養(yǎng)的效果最好。

        表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)單芽莖段離體培養(yǎng) 的影響

        2.4 莖尖來(lái)源對(duì)微芽嫁接增殖倍數(shù)和利用率的影響

        在莖段培養(yǎng)的增殖過(guò)程中,單芽莖段多存在部分不定芽不具莖尖無(wú)法進(jìn)行脫毒試驗(yàn)。單芽莖段和多芽莖段的不定芽的生長(zhǎng)速度均不一致,反復(fù)拿出莖段取出莖尖的過(guò)程會(huì)增加污染率,導(dǎo)致后續(xù)得到的莖尖無(wú)法利用。因此,對(duì)不同莖尖來(lái)源的增殖倍數(shù)和利用率做了對(duì)比,其中,單芽莖段使用最佳培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA 培養(yǎng),多芽莖段使用MS 基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明(表4),從培養(yǎng)室直接采取莖尖進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)無(wú)法增殖,多芽莖段的不定芽再生增殖倍數(shù)為2.2,單芽莖段的不定芽再生增殖倍數(shù)最大,可達(dá)3.0,顯著高于多芽莖段的不定芽。但多芽莖段不定芽利用率顯著高于單芽莖段不定芽利用率,達(dá)81.8%。同時(shí),在外植體數(shù)量相同的情況下,由于腋芽數(shù)量的差異會(huì)影響獲得的可用芽數(shù)量,多芽莖段產(chǎn)生的不定芽數(shù)量顯著高于單芽莖段。綜上所述,使用多芽莖段產(chǎn)生不定芽的方式來(lái)獲得莖尖進(jìn)行脫毒試驗(yàn)的方法最優(yōu)。

        表4 莖尖來(lái)源對(duì)微芽嫁接增殖倍數(shù)和利用率的影響

        3 討論與結(jié)論

        雖然利用成年態(tài)組織培養(yǎng)已經(jīng)有一定的培養(yǎng)體系,但外部細(xì)菌、真菌和內(nèi)生菌較多,導(dǎo)致污染率高和褐化率高的問(wèn)題一直存在。利用脫除內(nèi)外種皮的方法減少萌發(fā)阻力,是加快萌芽速度的有效方法。吳思?jí)舻萚8]研究表明,剝除內(nèi)外種皮使用不同消毒方法的污染率最高為5.6%。本研究在實(shí)際操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn),在超凈工作臺(tái)上剝除內(nèi)種皮需要較長(zhǎng)時(shí)間,可能由于人為操作不當(dāng),污染率增加。從試驗(yàn)結(jié)果能看出,劃破內(nèi)種皮的方式可以大幅減少操作時(shí)間,降低污染率。陳國(guó)華等[9]發(fā)現(xiàn),0.1%HgCl2消毒效果比10%NaClO 溶液好,最高成活率可達(dá)86.09%。由于升汞的安全系數(shù)不高,本研究還是采用NaClO 消毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaClO 濃度達(dá)到5%時(shí),褐化率高達(dá)90.0%,萌芽率僅為5.0%,可能是由于采集的莖段成熟度不一致,與陳澤雄等[10]發(fā)現(xiàn)不同成熟度的材料消毒效果不同的研究結(jié)果相一致。很多研究表明,不同季節(jié)、不同天氣取樣會(huì)影響污染率[8,11]。本研究選擇在晴天干燥的環(huán)境下取樣,以降低污染率,但試驗(yàn)進(jìn)程非常緩慢??紤]到田間環(huán)境微生物眾多,故在培養(yǎng)室中直接培養(yǎng)原材料能控制環(huán)境條件,結(jié)果也表明在干凈的環(huán)境條件下生長(zhǎng)的外植體污染率均只有20.0%,且使用1%NaClO 消毒時(shí)培養(yǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)的外植體較室外生長(zhǎng)的外植體污染率顯著降低。

        將莖尖嫁接在無(wú)毒砧木上解決了發(fā)根難、生長(zhǎng)慢等問(wèn)題,應(yīng)用十分廣泛。由于田間采集接穗受季節(jié)、天氣影響較大,多數(shù)研究者利用組織培養(yǎng)獲得莖尖進(jìn)行脫毒。前人多對(duì)莖段先進(jìn)行初代培養(yǎng)再進(jìn)行繼代培養(yǎng)以獲得莖尖,劉月[12]的研究結(jié)果表明,6-BA 的濃度越高,誘導(dǎo)率越高,但超過(guò)1.0 mg/L 時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致愈傷組織增加、不定芽質(zhì)量降低。本研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)成功后側(cè)芽會(huì)陸續(xù)冒出,可直接增殖來(lái)獲得莖尖加快脫毒效率,但不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平下不定芽的粗壯程度不同。6-BA 濃度為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時(shí),對(duì)‘由良’單芽莖段離體培養(yǎng)效果最好,萌芽率為91.6%,增殖倍數(shù)為3.0。

        陳毅群等[13]、李麗[14]的研究表明,采集田間接穗進(jìn)行微芽嫁接受季節(jié)影響較大,夏季萌發(fā)率最高,春秋季萌芽率顯著低于夏季,利用誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行微芽嫁接的萌發(fā)率不受季節(jié)影響且顯著高于田間芽。本試驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)室培養(yǎng)原材料,控制溫濕度讓植株處于最佳抽梢環(huán)境條件,也可避免接穗受季節(jié)影響導(dǎo)致萌發(fā)率不高的現(xiàn)象,但結(jié)果表明脫毒使用的莖尖在萌芽1 周左右采集脫毒效率最高,無(wú)法在短期內(nèi)將植株上所有莖尖全部利用上,而通過(guò)莖段培養(yǎng),可以分批次獲取莖尖。試驗(yàn)結(jié)果表明,使用多芽莖段培養(yǎng)的不定芽利用率最高,達(dá)81.8%。

        莖尖嫁接技術(shù)是目前使用最廣泛的柑橘脫毒技術(shù),此前多在莖尖大小、嫁接方法上研究以提高脫毒率,本研究主要利用組織培養(yǎng)獲得莖尖,以打破季節(jié)限制加快脫毒效率。在前人基礎(chǔ)上對(duì)種子、成年態(tài)莖段消毒方法和培養(yǎng)方法及莖尖來(lái)源進(jìn)行研究,在一定程度上增加了獲取莖尖的數(shù)量和質(zhì)量。

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