王瑜亮，萬(wàn)新煥，張?jiān)圃?，肖童，李福偉，高紅梅，劉桂娟，林云良*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；3.濟(jì)南美高生物醫(yī)藥科技有限公司，山東 濟(jì)南 250119)

自20世紀(jì)30年代核磁共振現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)其的研究就從未停止。作為一項(xiàng)現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，核磁共振波譜主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、食品、化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域，尤其是在有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)確證方面具有無(wú)可替代的作用，目前已廣泛應(yīng)用于小分子及大分子結(jié)構(gòu)和濃度的測(cè)定[1]?；凇昂舜殴舱裥盘?hào)強(qiáng)度(I)與激發(fā)核(N)的數(shù)量成正比”這一原理[2]，核磁共振方法可應(yīng)用于定量實(shí)驗(yàn)。早在1963年，就有學(xué)者利用定量核磁共振技術(shù)分析了制劑中阿司匹林、非那西丁和咖啡因的比例[3]。近年來(lái)，定量核磁共振技術(shù)應(yīng)用越發(fā)廣泛，例如藥品含量測(cè)定[4～5]、中藥材質(zhì)量控制[6]、食品成分檢測(cè)[7]、化工中間體定量分析[8]以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量測(cè)定[9]等。

碘甲烷是有機(jī)合成中常用的甲基化試劑，常常作為有機(jī)化合物的生產(chǎn)原料。而碘甲烷被氘代后，可作為氘代標(biāo)記試劑，用來(lái)合成某些化合物或新藥，例如有學(xué)者利用氘代碘甲烷合成藥物吡羅昔康-d3[10]。因此，氘代碘甲烷的氘代率對(duì)其后續(xù)產(chǎn)物的成敗至關(guān)重要，但是通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)近年來(lái)關(guān)于化合物氘代率檢測(cè)的報(bào)道較少[11～13]。

本文就氘代碘甲烷的氘代率檢測(cè)方法進(jìn)行研究，采用定量核磁共振氫譜，加入內(nèi)標(biāo)物比對(duì)，測(cè)定氘代碘甲烷中殘留的氫信號(hào)，從而計(jì)算氘代率。定量核磁共振法的優(yōu)點(diǎn)是不需要自身對(duì)照品，且樣品前處理過(guò)程較簡(jiǎn)便[1]，因此將其應(yīng)用于氘代化合物的氘代率測(cè)定尤為合適。本方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便快捷，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室中氘代碘甲烷的氘代率測(cè)定，可以應(yīng)用到企業(yè)的產(chǎn)品檢測(cè)、生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制以及化學(xué)反應(yīng)過(guò)程的監(jiān)控當(dāng)中。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Bruker Avance Ⅲ HD 400MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；XPR205型十萬(wàn)分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；20～200 μL移液器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑

氘代碘甲烷[MG20715批，氣相色譜/火焰離子化檢測(cè)器(GC/FID)方法測(cè)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.70%；MG20716D批，GC/FID方法測(cè)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.72%；MG20719B批，GC/FID方法測(cè)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.71%；以上3批均來(lái)自濟(jì)南美高生物醫(yī)藥科技有限公司]；對(duì)苯二甲酸二甲酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，Dr Ehrenstorfer GmbH公司)；氘代二甲基亞砜(DMSO-d6，氘代度99.9%，體積分?jǐn)?shù)為0.03% 的四甲基硅烷，Cambridge Isotope Laboratories公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 供試品溶液的配制

精密稱取對(duì)苯二甲酸二甲酯11.77 mg，置10 mL容量瓶中，加DMSO-d6使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)物貯備液(1.177 mg/mL)，備用。

精密移取氘代碘甲烷0.2 mL、內(nèi)標(biāo)物貯備液0.2 mL，置5 mm核磁管中，加入DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為供試品溶液。

2.1.2 定量核磁共振實(shí)驗(yàn)參數(shù)

采用Bruker核磁共振波譜儀，使用zg脈沖序列(90°脈沖)，于24 ℃下進(jìn)行核磁分析。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：譜寬(spectral width，SWH)為4 807.69 Hz；激發(fā)偏置(transmitter frequency offset，O1)為2 000.65 Hz；弛豫延遲時(shí)間(delay time 1，D1)為65 s；脈沖寬度(Pulse 1，P1)為11.80 μs；空掃次數(shù)(number of dummy scans，DS)為2，掃描次數(shù)(number of scans，NS)為16，采樣時(shí)間(Acquisition time，AQ)為6.82 s，窗函數(shù)(line broadening for em，LB)為0.3 Hz。

2.2 氘代率計(jì)算公式

氘代率為分子中氫原子被氘原子取代的百分率。本文采用摩爾分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算，用實(shí)際的氘原子摩爾數(shù)除以全部理論氘原子摩爾數(shù)獲得氘代率。在實(shí)際氫譜測(cè)試中，氘代碘甲烷的殘留氫信號(hào)為5重峰，系2個(gè)氘原子對(duì)氫原子耦合裂分產(chǎn)生，因此樣品中殘留的非全氘物質(zhì)為CHD2I，因此我們只需要測(cè)出樣品中CHD2I的質(zhì)量，即可計(jì)算氘代率。如式(1)～(2)。

(1)

(2)

式中，W2為二氘碘甲烷的質(zhì)量(mg)；Ws為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量(mg)；Wx為待測(cè)物的質(zhì)量(mg)；Ms為內(nèi)標(biāo)物分子量(194.19)；M2為二氘碘甲烷分子量(143.95)；M3為氘代碘甲烷分子量(144.96)；As為內(nèi)標(biāo)物峰面積；A2為二氘碘甲烷峰面積；hs為內(nèi)標(biāo)峰理論氫數(shù)；h2為二氘碘甲烷理論氫數(shù)。

2.3 氘代試劑及內(nèi)標(biāo)物的確定

定量核磁共振實(shí)驗(yàn)在氘代溶劑的選擇上，應(yīng)滿足對(duì)待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)物均有較好的溶解度，同時(shí)應(yīng)考慮溶劑峰與待測(cè)物峰、內(nèi)標(biāo)物定量峰不發(fā)生干擾或重疊。在內(nèi)標(biāo)物的選擇上，應(yīng)考慮采用純度高、易于稱量、不與待測(cè)物質(zhì)相互作用、易溶于氘代試劑、定量峰與鄰近峰信號(hào)不干擾的化合物[14]。本文考察了氘代三氯甲烷(CDCl3)與DMSO-d6兩種氘代溶劑，選擇對(duì)苯二甲酸二甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，發(fā)現(xiàn)CDCl3、DMSO-d6對(duì)氘代碘甲烷、內(nèi)標(biāo)物均能較好的溶解，但CDCl3密度大、易揮發(fā)，精密移取操作比DMSO-d6困難，故最終確定DMSO-d6為氘代試劑。按氫譜條件測(cè)定譜圖，內(nèi)標(biāo)定量峰與待測(cè)峰分離良好，其中，各峰兩兩之間最小分離度為15.3，完全滿足定量要求。本文選擇δ8.07處信號(hào)作為內(nèi)標(biāo)峰，δ2.16處信號(hào)為待測(cè)峰進(jìn)行計(jì)算。供試品溶液1H-NMR圖譜如圖1所示。

圖1 供試品溶液1H-NMR圖譜Fig.1 1H-NMR spectrum of the test solution

2.4 供試品制備方法的確定

因氘代碘甲烷沸點(diǎn)低，極易揮發(fā)，較難準(zhǔn)確稱量，故在控制室溫(25.0±0.5)℃的條件下，精密量取固定體積，再乘以25 ℃時(shí)的密度2.329 mg/μL來(lái)獲得氘代碘甲烷的重量，通過(guò)此方式減小取樣誤差。另外，由于氘代碘甲烷中殘留的氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，為了使二氘碘甲烷峰與內(nèi)標(biāo)峰面積基本一致，降低積分誤差，故內(nèi)標(biāo)物的濃度不宜太大，而極少量的內(nèi)標(biāo)物稱量又存在較大的稱量誤差，故選擇將內(nèi)標(biāo)物配制成一定濃度的貯備液，每次量取固定體積來(lái)配制供試品溶液。

2.5 儀器參數(shù)的考察

定量核磁共振的儀器參數(shù)對(duì)結(jié)果至關(guān)重要，只有合理的參數(shù)才使得結(jié)果具有準(zhǔn)確性。首先我們確定了90°脈沖角度(zg)作為測(cè)定脈沖，因?yàn)樵摻嵌瓤稍趚y平面上產(chǎn)生可檢測(cè)的最大磁化強(qiáng)度。其次，儀器的延遲時(shí)間D1值需大于化合物弛豫時(shí)間T1值的5倍，此時(shí)該化合物中有99.3%的高能態(tài)核回到低能態(tài)，達(dá)到平衡[2]。本實(shí)驗(yàn)采用Bruker質(zhì)子反轉(zhuǎn)-恢復(fù)T1方法，選擇脈沖序列t1ir，T1 delay設(shè)置為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 s，測(cè)量供試品溶液中各峰的T1值，結(jié)果各峰T1值均小于13 s，如表1所示，因此我們?cè)O(shè)定D1值為65 s。另外，掃描次數(shù)NS可決定圖譜的信噪比S/N，NS越大信噪比越好，但檢測(cè)時(shí)間也越長(zhǎng)，本文考察NS在16、32、64、128次條件下各峰信噪比，結(jié)果在NS為16時(shí)，圖譜中δ8.07、δ3.89、δ2.16處信號(hào)的信噪比均大于300，完全滿足《歐洲藥典》中定量核磁檢測(cè)信噪比≥150的要求[15]，為節(jié)約測(cè)定時(shí)間選擇NS為16次。

表1 氘代碘甲烷與內(nèi)標(biāo)物各峰的T1值Table 1 T1 value of each peak of iodomethane-d3 and internal standard

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密移取氘代碘甲烷0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mL，分別置5支5 mm核磁管中，每支核磁管中分別加入內(nèi)標(biāo)物貯備液0.2 mL、DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為線性溶液1～5。按2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定1H-NMR譜，記錄積分面積，以供試品δ2.16處峰面積與內(nèi)標(biāo)物δ8.07處峰面積比值作為縱坐標(biāo)，以供試品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，做線性回歸，回歸方程為：y=0.001x+0.134 1，R=0.999 0，結(jié)果表明，氘代碘甲烷與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比在1 187.26～2 770.26線性關(guān)系良好。如表2所示。

表2 氘代碘甲烷與內(nèi)標(biāo)物線性關(guān)系表Table 2 Linear relationship between iodomethane-d3 and internal standard

2.6.2 儀器精密度

采用2.1.1項(xiàng)下方法配制1份供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定1H-NMR譜。以內(nèi)標(biāo)物δ8.07峰計(jì)算，非氘代率(100%-氘代率%)均值為0.101%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.52%，表明儀器的精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性

精密移取氘代碘甲烷0.16 mL(供試品濃度的80%)各3份、0.20 mL(供試品濃度的100%)各3份、0.24 mL(供試品濃度的120%)各3份，分別置9支5 mm核磁管中，每支核磁管中分別加入內(nèi)標(biāo)物貯備液0.2 mL、DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為重復(fù)性溶液1～9。按2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定重復(fù)性溶液的1H-NMR譜，以內(nèi)標(biāo)物δ8.07峰計(jì)算，氘代碘甲烷的非氘代率均值為0.100%、RSD為2.83%，表明本品氘代率測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.6.4 靈敏度

精密移取氘代碘甲烷適量，用DMSO-d6逐級(jí)稀釋制成一定濃度的溶液，按2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定1H-NMR譜，使得二氘碘甲烷峰信噪比約為10和3時(shí)，即獲得氘代碘甲烷測(cè)定的定量限、檢測(cè)限濃度。如表3所示。

表3 氘代碘甲烷靈敏度實(shí)驗(yàn)表Table 3 Sensitivity of iodomethane-d3

根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版四部通則要求[14]，當(dāng)信噪比為3或2時(shí)相應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，當(dāng)信噪比為10時(shí)相應(yīng)的濃度為定量限。本文以氫譜圖的信噪比為3～5時(shí)確定檢測(cè)限，以信噪比為10～15時(shí)確定定量限。表明該方法下氘代碘甲烷氘代率測(cè)定的最低濃度可以達(dá)到6.807 mg/mL。

2.6.5 穩(wěn)定性

采用2.1.1項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，測(cè)定1H-NMR譜。以內(nèi)標(biāo)物δ8.07峰計(jì)算非氘代率，將各結(jié)果與0 h相比，最大變化率為3.92%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。如表4所示。

表4 氘代率檢測(cè)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表Table 4 Stability of deuteration rate detection

2.6.6 耐用性

采用2.1.1項(xiàng)下方法配制供試品溶液，以2.1.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件作為標(biāo)準(zhǔn)條件，在此基礎(chǔ)上調(diào)整儀器參數(shù)，測(cè)定1H-NMR譜。各條件下的譜圖經(jīng)考察，內(nèi)標(biāo)峰與待測(cè)峰的信噪比均大于300，滿足定量要求。以內(nèi)標(biāo)物δ8.07峰計(jì)算非氘代率。結(jié)果表明本文方法耐用性良好。如表5所示。

表5 氘代率檢測(cè)耐用性試驗(yàn)表Table 5 Durability of deuteration rate detection

2.7 圖譜處理方法

選取氘代溶劑DMSO-d6中的四甲基硅烷峰作為0點(diǎn)定標(biāo)，在全譜寬范圍執(zhí)行自動(dòng)相位校正、自動(dòng)基線校正，使得峰左右對(duì)稱，基線平整。對(duì)參與計(jì)算的各峰進(jìn)行積分，積分范圍包括“目標(biāo)峰的2個(gè)碳衛(wèi)星信號(hào)之間的整個(gè)區(qū)域”，重復(fù)積分5次，峰面積RSD小于1%時(shí)取平均值。

2.8 典型樣品的氘代率測(cè)定

采用本文既定方法，對(duì)三批典型樣品進(jìn)行氘代率測(cè)定，重復(fù)測(cè)定3次取平均值，結(jié)果分別為99.90%(MG20715批)、99.88%(MG20716D批)、99.87%(MG20719B批)。

2.9 討論

有關(guān)氘代化合物的表征方法有很多，如紅外光譜法、拉曼光譜法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、燃燒-分光光度法等，但實(shí)際可用于氘代率計(jì)算的方法卻不多。其中，核磁共振方法應(yīng)用最多，例如“相對(duì)質(zhì)量校正因子法”“1H-NMR與2H-NMR共同測(cè)定方法”[13]。前者需要待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，且需測(cè)量校正因子；后者需要進(jìn)行氫譜與氘譜兩種實(shí)驗(yàn)，且需要高純非氘代試劑。相比而言，本方法無(wú)需待測(cè)物自身標(biāo)準(zhǔn)品，前處理過(guò)程方便，僅需一次檢測(cè)即可獲得結(jié)果。

關(guān)于氘代率的計(jì)算公式，有文獻(xiàn)報(bào)道在計(jì)算DMSO-d6的氘代率過(guò)程中，將氫譜圖中的定量峰以二甲基亞砜(CH3SOCH3)形式進(jìn)行計(jì)算[12]，但在實(shí)際化學(xué)反應(yīng)中，殘留下的幾乎不可能是完全沒(méi)有被氘代的物質(zhì)。另外，通過(guò)理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)，以質(zhì)量計(jì)算氘代率和以摩爾數(shù)計(jì)算氘代率結(jié)果也存在一定差異，按照氘代率的嚴(yán)格定義，應(yīng)當(dāng)使用摩爾數(shù)計(jì)算氘代率。因此，本文將氘代碘甲烷的非氘物質(zhì)確定為CHD2I，并以氘原子的摩爾數(shù)計(jì)算氘代率。

本實(shí)驗(yàn)選取內(nèi)標(biāo)物的苯環(huán)氫(δ8.07)進(jìn)行氘代率計(jì)算，另外還考察了用內(nèi)標(biāo)物的甲基氫(δ3.89)進(jìn)行計(jì)算的結(jié)果。結(jié)果表明，兩種選峰方式的氘代率基本一致，但以甲基峰計(jì)算時(shí)，個(gè)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍偏高0.01%，推測(cè)可能是由于甲基峰距離體系中δ3.2水峰較近，導(dǎo)致基線略微偏高、積分面積稍偏大，最終帶入公式計(jì)算后氘代率偏高。因此以內(nèi)標(biāo)物的苯環(huán)氫(δ8.07)進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果更為準(zhǔn)確。

此外，本方法學(xué)考察過(guò)程中選擇了非氘代率(100%-氘代率)作為統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)，可以更加真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)方法中“二氘碘甲烷峰面積÷內(nèi)標(biāo)物峰面積”與取樣量的關(guān)系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估也較為合理。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)溶劑進(jìn)行篩選，確定了DMSO-d6為氘代試劑、對(duì)苯二甲酸二甲酯為內(nèi)標(biāo)物的核磁方法，并優(yōu)化了D1、NS等儀器參數(shù)，最終確定D1為65 s、NS為16次，并參考《中國(guó)藥典》2020版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，建立了氘代碘甲烷的氘代率測(cè)定方法，同時(shí)還對(duì)幾批典型樣品進(jìn)行了氘代率檢測(cè)，表明定量核磁共振氫譜適用于氘代碘甲烷的氘代率分析。該方法操作便捷，耗時(shí)較短，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室中氘代碘甲烷氘代率的檢測(cè)。另外，該方法的開(kāi)發(fā)為定量核磁共振實(shí)驗(yàn)拓寬了應(yīng)用范圍，也為其他氘代化合物氘代率測(cè)定提供了一個(gè)思路。