孫丹丹，姜婷，王剛，胡勇

(青島市中醫(yī)醫(yī)院 ，山東 青島 266033)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指長期大量攝入酒精所致的肝臟損傷[1]，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化，甚至?xí)l(fā)展為肝癌[2]。肝癌是最致命的癌癥之一，是我國第二常見癌癥[3]。目前西醫(yī)主要是在戒酒、營養(yǎng)支持的基礎(chǔ)上采用藥物治療，而中醫(yī)藥對酒精性肝病具有較好的治療效果[4-5]。丹參具有心肌保護(hù)、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[6]，柴胡具有免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁、保肝、抗腫瘤、退熱、抗炎等藥理作用[7]?，F(xiàn)代研究表明，逍遙散(君藥柴胡)能降低酒精對肝臟的損傷，降低大鼠血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)的含量，降低肝組織中丙二醛 (MDA)含量，提高肝組織谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，逍遙散可抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來降低肝細(xì)胞的損傷[8]。丹參中的丹酚酸B可降低小鼠肝中ALT、AST、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量，其作用機(jī)制是降低TNF-α和IL-6水平,通過激活SIRT1來降低CRP和ChREBP的表達(dá)[9]?；跀?shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)用丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的使用頻次最高[10]，但丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對丹參-柴胡藥對的主要化學(xué)成分及其治療酒精性肝病的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)地預(yù)測分析，為丹參-柴胡藥對的后續(xù)實驗研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 篩選丹參-柴胡的化學(xué)成分和靶點基因

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，分別輸入丹參、柴胡，得到其主要化學(xué)成分和靶點基因。選擇口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug like,DL)≥0.18的篩選條件，獲得丹參、柴胡的化學(xué)成分。通過UniProt數(shù)據(jù)庫 (https://www.uniprot.org/)，限定物種為“Homo Sapien”，將化學(xué)成分的相關(guān)靶點轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的基因。通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，預(yù)測化學(xué)成分的潛在基因靶點。將UniProt數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫搜索到的化合物基因靶點合并，刪除重復(fù)基因，獲取丹參-柴胡的靶基因。

1.2 酒精性肝病的靶點搜集

選擇酒精性肝病關(guān)鍵詞“alcoholic liver disease”，通過人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)(https://omim.org/)，得到疾病相關(guān)基因。將疾病基因與藥物基因映射，選出交集基因，即藥物治療疾病的潛在靶基因。

1.3 成分靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

創(chuàng)建“藥物與成分”“成分與靶點”“疾病與靶點”關(guān)系的文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。在該網(wǎng)絡(luò)中，化合物和靶點用節(jié)點(node)代表，化合物與靶點間的相互聯(lián)系用邊(edge)代表。為了分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，可以參照網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)：節(jié)點度、節(jié)點介度和節(jié)點緊密度。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過String平臺(https://string-db.org/)，構(gòu)建靶蛋白蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteir interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，物種為“Homo Sapiens”，等值置信度為0.4、0.7和0.9，其余參數(shù)為不變。下載蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)中的tsv文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.5 基因功能和通路富集分析

通過Metascape平臺，分析丹參-柴胡對抗酒精性肝病的關(guān)鍵靶點，輸入物種和分析物種為“Homo Sapiens”，進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)注釋分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析，篩出排名靠前的生物過程和通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參-柴胡藥對主要活性成分篩選

用TCMSP數(shù)據(jù)庫，得到202個丹參活性成分、349個柴胡活性成分，篩選后，得到65個丹參候選化合物、17個柴胡的候選化合物，刪除9個無靶點成分，共得73個活性成分，見表1。

表1 丹參、柴胡的主要有效活性成分Table 1 The main effective active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix

2.2 丹參-柴胡藥對作用靶點預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索出932個丹參靶點、348個柴胡靶點，分別刪除重復(fù)項，獲得139個丹參靶點、197個柴胡靶點；基于SwissTargetPrediction平臺，獲得69個丹參靶點、134個柴胡靶點，分別合并兩個數(shù)據(jù)庫基因，重復(fù)項刪除，得到162個丹參靶點、251個柴胡靶點。

2.3 丹參、柴胡藥對治療酒精性肝病的靶點預(yù)測

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫，獲得7685個酒精性肝病相關(guān)靶基因，以Relevance score值≥21.69為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出963個靶基因。利用OMIM數(shù)據(jù)庫找到519個與酒精性肝病相關(guān)的基因。合并基因并刪除重復(fù)基因，得到1411個疾病相關(guān)基因。將藥物與疾病的靶點基因進(jìn)行映射，得到交集基因，丹參治療酒精性肝病的潛在靶點98個、柴胡137個，將重復(fù)項刪除，得到161個靶基因，預(yù)測為丹參-柴胡藥對治酒精性肝病的靶基因。

2.4 成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖1所示為成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖，圖1編號見表2。161個丹參-柴胡藥對的靶基因建立成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共有節(jié)點184個、邊256條?；钚猿煞旨鞍悬c用節(jié)點代表，活性成分與靶點的相互聯(lián)系用邊代表。丹參-柴胡藥對具有多成分、多靶點治療酒精性肝病的作用機(jī)制。

注：黃色表示丹參TCMSP編號活性成分，紫色表示柴胡TCMSP編號活性成分，藍(lán)色表示丹參、柴胡共有的TCMSP編號活性成分，綠色表示治療酒精性肝病潛在靶點。圖1 丹參、柴胡活性成分-酒精性肝病靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of the active ingredient targets of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

表2 圖1編號注釋Table 2 Numbered notes for Figure 1

經(jīng)計算，該網(wǎng)絡(luò)的連接度(degree)平均值是2.78，介度(BC)平均值是0.01，緊密度(CC)平均值是0.3。槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山奈酚、丹參酮IIA、植物甾醇、黃芩苷等7種成分的拓?fù)鋮?shù)均大于其平均值，這些成分可能是丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的主要活性成分。主要活性成分的拓?fù)鋮?shù)見表3。

表3 主要活性成分拓?fù)鋮?shù)Table 3 Topological parameters of the main active ingredients

2.5 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖2所示為PPI網(wǎng)絡(luò)圖，中等置信度=0.4時，共有節(jié)點161個，邊3273條。通過計算，整個網(wǎng)絡(luò)degree的中位數(shù)=34，選擇degree≥68為候選靶點，同時BC和CC的值也選擇大于中位數(shù)的靶點為關(guān)鍵靶點26個。將26個基因靶點導(dǎo)入UniProt平臺，得到基因?qū)?yīng)的蛋白名稱，見表4。

圖2 丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of the target proteins of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

表4 26個中心靶點信息Table 4 Information regarding the 26 hub targets

2.6 GO注釋分析和KEGG富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫，GO注釋分析和KEGG通路分析161個基因靶點，利用GraphPad Prism8.0軟件，將分析結(jié)果可視化。結(jié)果見圖3。

GO注釋分析包括生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)三部分。由圖3可知，BP(圖3(a))中主要有對無機(jī)物的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對受傷的反應(yīng)等。CC分析(圖3(b))中主要是膜筏、枝晶、受體復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、核體、裂解液泡等。MF分析(圖3(c))主要是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、氧化還原酶活性等。

KEGG通路分析(圖3(d))，丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病靶點涉及的通路中，主要有腫瘤信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、內(nèi)分泌抵抗、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。

圖3 丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病潛在靶點的GO注釋分析與KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analyses of the potential targets of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

3 討論

酒精性肝炎是由于過量飲酒引起的肝組織炎癥和壞死，甚至?xí)鹌鞴偎ソ?。丹參具有活血祛瘀、通?jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，柴胡具有透表泄熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效[11]。丹參-柴胡藥對的主要化學(xué)成分有：槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山奈酚、丹參酮IIA、植物甾醇、黃芩苷等?，F(xiàn)代研究表明，槲皮素是多酚類中的一種黃酮化合物，具有自由基清除能力和抗炎作用，槲皮素可以通過上調(diào)IL-10和HO-1的表達(dá)，從而抑制NLRP3炎性體的激活和炎性因子的分泌，從而保留肝臟在急性酒精中毒中的功能[12]；槲皮素可通過維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路、抑制炎癥因子釋放、控制相關(guān)酶的合成與釋放等方面對化學(xué)性肝損傷發(fā)揮抗氧化和抗炎活性[13]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，可以抑制酒精誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積、脂肪形成基因表達(dá)，還可以抑制酒精誘導(dǎo)的AMP活化蛋白激酶的還原、SREBP-1c的磷酸化[14]。異鼠李素為槲皮素的直接衍生物，具有很好的抗炎、抗氧化、抗過敏等藥理作用，可通過抑制脂肪的生成降低肝內(nèi)的脂肪和甘油三酯[15]。山奈酚為一種黃酮類化合物，可以逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷小鼠回腸和近端結(jié)腸中TJ蛋白ZO-1和閉塞素、丁酸受體和丁酸轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，從而預(yù)防酒精性肝損傷[16]；山奈酚可通過降低CYP2E1的活性和表達(dá)、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，從而保護(hù)酒精引起的肝損傷[17]。黃芩苷為一種黃酮類化合物，可以通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)生刺猬通路等途徑，保護(hù)酒精所致的肝損傷[18]。丹參酮IIA、植物甾醇也具有保護(hù)肝臟細(xì)胞的作用[19-20]。

通過構(gòu)建關(guān)鍵靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因，AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、EGF位于基因核心位置。AKT1(蛋白激酶B,PKB)是一種大分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在暴飲酒精所致的肝損傷中，AKT1可促進(jìn)纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，因此可靶向抑制AKT1進(jìn)行治療[21]。IL6是一種促炎因子，參與急性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展，可導(dǎo)致肝細(xì)胞及線粒體的損害，抑制IL6在血液循環(huán)中的表達(dá)，可保護(hù)肝臟功能[22]。TP53突變是肝細(xì)胞癌中最常見的基因突變，會導(dǎo)致肝細(xì)胞癌免疫反應(yīng)下調(diào)，312個免疫應(yīng)答相關(guān)基因中有37個是與TP53突變而差異表達(dá)[23]。VEGFA是一種保護(hù)脂肪肝的基因，可通過VEGFR2-PI3K/Akt途徑保護(hù)肝臟[24]。TNF、CASP3兩種基因的產(chǎn)生都會導(dǎo)致肝臟的損傷[25-26]。

丹參和柴胡的GO注釋分析主要有對無機(jī)物的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對受傷的反應(yīng)、膜筏、枝晶、受體復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、核體、溶泡、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、氧化還原酶活性等，KEGG分析主要有腫瘤信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、內(nèi)分泌抵抗、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的丹參、柴胡的活性成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究主要依賴于公共數(shù)據(jù)庫，其準(zhǔn)確性、可靠性、完善性對預(yù)測結(jié)果有很大影響，再者，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于方劑中藥物的不同配比無法確定，故也存在一定的局限[27]。

綜上所述，根據(jù)中藥網(wǎng)絡(luò)學(xué)的研究方法，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，闡述了丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的作用機(jī)制是多成分、多靶點、多通路，未來將進(jìn)行分子生物學(xué)驗證，并結(jié)合體內(nèi)外實驗進(jìn)行進(jìn)一步驗證。