脫 萍，謝 熙，喻國洪，朱冬發(fā)

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹屬(Portunus)，生長速度快、市場價(jià)值高、經(jīng)濟(jì)潛力大，是我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹類[1]。但同類相殘、養(yǎng)殖成活率低、養(yǎng)殖群體性早熟等問題仍困擾著三疣梭子蟹人工增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，單性養(yǎng)殖有助于降低同類相殘，提高成活率，并能有效控制養(yǎng)殖群體性早熟[2]。性別控制是實(shí)現(xiàn)單性化養(yǎng)殖的關(guān)鍵，然而，甲殼綱動(dòng)物性別決定和分化的調(diào)控機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為雄性發(fā)育是由促雄腺(androgenic gland，AG)分泌的胰島素樣促雄腺激素(insulin like androgenic gland hormone，IAG)來調(diào)控的[3]。通過一系列的促雄腺切除和移植實(shí)驗(yàn)，證明促雄腺在十足目甲殼動(dòng)物雄性性征的發(fā)育、維持及對雌性性征分化的抑制等方面具有關(guān)鍵作用。Sagi課題組通過RNA干擾雄性羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)IAG基因的表達(dá)，成功誘導(dǎo)雄性羅氏沼蝦性逆轉(zhuǎn)為“假雌性(neo-females)”，并將假雌性個(gè)體與正常雄性交配以產(chǎn)生全雄性的后代[4-5]。表明IAG基因在蝦蟹類雄性分化中的關(guān)鍵作用，也預(yù)示了基于IAG的性別調(diào)控技術(shù)具有良好的應(yīng)用潛力。三疣梭子蟹促雄腺較小，生化提取天然的IAG蛋白操作困難、獲得量較少、無法滿足生產(chǎn)需要[6]，體外制備IAG重組融合蛋白對研究其功能作用及分子機(jī)制具有重要意義。

IAG是由促雄腺分泌的一類蛋白類激素，因其與哺乳動(dòng)物胰島素類似，故命名為胰島素樣促雄腺激素[7]，是關(guān)鍵的性別分化調(diào)節(jié)因子[8]。IAG具有胰島素超家族蛋白質(zhì)的特征，其前體激素原與前胰島素原一致，從N端到C端依次是信號肽、B鏈、C肽和A鏈，信號肽和C肽被裂解成為成熟肽，由A鏈和B鏈通過2對二硫鍵互連而成，A鏈內(nèi)另有一對二硫鍵[9-10]。二硫鍵的正確配對對胰島素樣促雄腺激素的活性至關(guān)重要[11]。此外，A鏈處存在一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(NCT)以及兩個(gè)多肽裂解位點(diǎn)[12]。已有報(bào)道利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)表達(dá)了普通卷甲蟲(Armadillidiumvulgare)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)IAG重組融合蛋白，為包涵體表達(dá)[13-14]。pET原核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)常發(fā)生蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，產(chǎn)生非功能性包涵體蛋白，為了提高原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的溶解度，利用某些分子伴侶蛋白可以幫助目的蛋白折疊的特性，將這些分子伴侶與目的蛋白共表達(dá)以促進(jìn)蛋白的折疊[15-16]。

研究將已克隆到的三疣梭子蟹促雄腺IAG基因的cDNA序列(NCBI登錄號為MK355618)插入到不同的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)表達(dá)菌株，篩選原核表達(dá)系統(tǒng)并優(yōu)化表達(dá)條件，以期獲得高效表達(dá)的可溶性重組蛋白，為后續(xù)抗體制備以及功能研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

E.coliDH5α、Rosetta(DE3)和BL21(DE3)感受態(tài)均購自康為世紀(jì)，原核表達(dá)載體pET-22b、pET-28a和pET-28a-sumo均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、NcoI、Hind III和T4 DNA連接酶均為寶日醫(yī)生物公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、ECL發(fā)光液、PVDF膜、His-tag鼠多抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠購于康為世紀(jì)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天；蛋白預(yù)染Marker購于賽默飛世爾科技；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 Pt-IAG的引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Pt-IAG的cDNA序列運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)3對帶有酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的特異性引物，pET-22b重組載體目的基因上游引物F：5′-CATGCCATGGATG-TGCCTGCGCGTGATC-3′(下劃線為NcoI酶切位點(diǎn))，下游引物R：5′-GGGAAGCTTCTGCCTATTTCGGGAAG-CT-3′(下劃線為Hind III酶切位點(diǎn))。pET-28a重組載體目的基因上游引物F：5′-GGAATTCCATATGATGGC-GGGCAGATTTGAG-3′(下劃線為NdeI酶切位點(diǎn))，下游引物R：5′-CCGCTCGAGTTAGACCGCATTGGTGTGA-TCG-3′(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))；pET-28a-sumo重組載體目的基因上游引物F：5′-GGAATTCCATATGA-TGTGCCTGCGCGTGATC-3′(下劃線為NdeI酶切位點(diǎn))，下游引物R：5′-CCGCTCGAGTTACTGCCTAT-TTCGGGAAGCT-3′(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))；引物交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Pt-IAG的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

采集雄性三疣梭子蟹的促雄腺提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收和純化的目的片段連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對菌落PCR鑒定為陽性的重組菌，用限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、NcoI和Hind III對相應(yīng)的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，回收酶切產(chǎn)物，目的片段與表達(dá)載體在T4 DNA連接酶作用下4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR鑒定篩選陽性克隆菌株，送往上海生工生物工程有限公司測序，構(gòu)建成功的重組載體分別命名為pET-28a-IAG、pET-22b-IAG和pET-28a-sumo-IAG。

1.2.3 IAG在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將3個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)菌株。以1%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)影響蛋白誘導(dǎo)的3個(gè)主要因素，對成功表達(dá)的菌株進(jìn)行單因素試驗(yàn)[17]：(1)誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)的影響。將培養(yǎng)過夜的表達(dá)菌株以1%接種量于37 ℃，200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，在培養(yǎng)液IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，3個(gè)表達(dá)載體分別于37 ℃、28 ℃誘導(dǎo)6 h，16 ℃誘導(dǎo)16 h，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。(2)IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)的影響。將培養(yǎng)液中的IPTG終濃度分別設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L，并于16 ℃培養(yǎng)16 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。(3)誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)的影響。培養(yǎng)過夜的菌株以1%接種量培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，培養(yǎng)液IPTG終濃度為0.6 mmol/L，16 ℃，分別于1、2、3、4、5、6、16和24 h取樣2 mL，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4 pET-IAG重組蛋白的純化與質(zhì)譜鑒定

在最優(yōu)表達(dá)條件下，將成功表達(dá)IAG重組融合蛋白的Rosetta-pET-28a-sumo-IAG菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接至1 L的LB液體培養(yǎng)基(含Kanamycin 50 μg/mL)中，誘導(dǎo)后離心收集菌體，超聲破碎，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(康為世紀(jì)：CW0894)，用含有50、100和500 mmol/L咪唑的Tris-HCl(Tris-HCl濃度為50 mmol；200 mmol NaCl；0.1% tween20，10%甘油；pH 8.0)洗脫液洗脫[18]，收集洗脫液，分別取80 μL上述各梯度洗脫液與20 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，95 ℃變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，確定最佳洗脫濃度，使用Millipore超濾管對含有重組融合蛋白的洗脫液進(jìn)行濃縮，濃縮后的蛋白運(yùn)用Bradford法測定濃度，純化后的IAG重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用蛋白印跡裝置進(jìn)行Western Blot檢測分析，同時(shí)對誘導(dǎo)表達(dá)的條帶切膠送至上海中科新生命生物科技有限公司采用LC-MS-MS對酶解后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物鑒定

PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果(圖1)，在450 bp左右有明顯的亮帶，片段長度與目的條帶大小相符，表明目的基因克隆成功。

M：1 kb DNA Marker；泳道1～3：pET-22b-IAG、pET-28a-IAG、pET-28a-sumo-IAG表達(dá)載體的目的基因。圖1 IAG基因的PCR結(jié)果Figure 1 PCR amplification of IAG gene

2.2 重組載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果(圖2)，酶切后出現(xiàn)2條條帶，一條為目的條帶，位于450 bp左右，一條為酶切后載體片段，位于2 000 bp以上。表明利用基因工程方法成功得到重組原核表達(dá)載體pET-22b-IAG、pET-28a-IAG和pET-28a-sumo-IAG。

M：2 kb DNA Marker；1：pET-22b-IAG；2：Nco I、Hind III雙酶切pET-22b-IAG；3：pET-28a-IAG；4：Nde I、Xho I雙酶切pET-28a-IAG；5：pET-28a-sumo-IAG；6：Nde I、Xho I雙酶切pET-28a-sumo-IAG。圖2 重組載體雙酶切鑒定Figure 2 Identification of recombinant vector plasmids by restriction enzyme digestion

2.3 IAG重組蛋白在不同原核表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)

分別誘導(dǎo)含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-IAG、pET-28a-IAG和pET-28a-sumo-IAG的原核表達(dá)菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)，進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3)。由圖3可知，IAG重組融合蛋白在BL21-pET-28a-sumo-IAG[圖3(a)6泳道]及Rosetta-pET-28a-sumo-IAG[圖3(b)6泳道]中均有表達(dá)，Rosetta-pET-28a-sumo-IAG菌株蛋白表達(dá)條帶亮度明顯高于BL21-pET-28a-sumo-IAG，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用Rosetta(DE3)表達(dá)菌株。

2.4 pET-28a-sumo-IAG在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的表達(dá)

2.4.1 最佳誘導(dǎo)溫度

在其他條件一致的情況下，在16 ℃、28 ℃和37 ℃誘導(dǎo)溫度下重組融合蛋白的表達(dá)量有差異(圖4)，在16 ℃條件下pET-28a-sumo-IAG蛋白條帶亮度明顯高于28 ℃和37 ℃，16 ℃即為IAG表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度。

2.4.2 最佳誘導(dǎo)物濃度

在16 ℃條件下，隨著誘導(dǎo)劑濃度升高，重組融合蛋白表達(dá)量先增加后降低(圖5)，濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)條帶最亮(泳道4)，其他濃度誘導(dǎo)重組蛋白條帶較暗且無明顯變化，該融合蛋白的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L。

2.4.3 最佳誘導(dǎo)時(shí)間

16 ℃，0.6 mmol/L IPTG經(jīng)0～24 h誘導(dǎo)后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，重組融合蛋白的表達(dá)條帶亮度逐步增加(圖6)，在16 h重組融合蛋白的條帶最亮，表達(dá)量最高(泳道8)，IAG重組融合蛋白的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。

(a)M：蛋白預(yù)染Marker；1～6：BL21-pET-22b-IAG誘導(dǎo)前、BL21-pET-22b-IAG誘導(dǎo)后、BL21-pET-28a-IAG誘導(dǎo)前、BL21-pET-28a-IAG誘導(dǎo)后、BL21-pET-28a-sumo-IAG誘導(dǎo)前、BL21-pET-28a-sumo-IAG誘導(dǎo)后。(b)M：蛋白預(yù)染Marker；1～6：Rosetta-pET-22b-IAG誘導(dǎo)前、Rosetta-pET-22b-IAG誘導(dǎo)后、Rosetta-pET-28a-IAG誘導(dǎo)前、Rosetta-pET-28a-IAG誘導(dǎo)后、Rosetta-pET-28a-sumo-IAG誘導(dǎo)前、Rosetta-pET-28a-sumo-IAG誘導(dǎo)后。圖3 重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中的表達(dá)Figure 3 Expression of recombinant vector plasmid in E.coli BL21 (DE3)and Rosetta (DE3)

M：蛋白預(yù)染Marker；1：誘導(dǎo)前；泳道2～4：分別為16 ℃、28 ℃、37 ℃誘導(dǎo)后全菌蛋白。圖4 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression of the IAG fusion protein at different temperatures

M：蛋白預(yù)染Marker；1：誘導(dǎo)前；泳道2～6：分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的菌液。圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of expression of the IAG fusion protein at different concentrations of IPTG

M：蛋白預(yù)染Marker；1：誘導(dǎo)前；泳道2～9：分別為誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、16和24 h后的菌液。圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間的SDS-PAGE分析Figure 6 SDS-PAGE analysis of expression of the IAG fusion protein at different induction time

2.5 IAG重組融合蛋白的純化及鑒定

最佳誘導(dǎo)條件即16 ℃，0.6 mmol/L IPTG，培養(yǎng)Rosetta-pET-28a-sumo-IAG 16 h，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，結(jié)果顯示，上清液、沉淀(泳道3、泳道4)均有大量的重組融合蛋白[圖7(a)]。對得到的上清液用Ni柱進(jìn)行純化，不同濃度的咪唑溶液洗脫，收集含有目標(biāo)蛋白的洗脫液，經(jīng)過超濾濃縮后，條帶較亮且無其他雜帶，純度大于85%[圖7(b)]。應(yīng)用Bradford法測定濃縮后的蛋白濃度為0.95～1.17 mg/mL。收集洗脫前后菌液進(jìn)行Western Blot分析，誘導(dǎo)前有微弱的結(jié)合條帶，表明IAG重組融合蛋白有微量的本底表達(dá)，誘導(dǎo)后菌液，破碎菌體上清液及沉淀均可與HRP標(biāo)記的His-tag多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，且與重組融合蛋白條帶大小一致[圖7(c)]。

切取純化后的目標(biāo)條帶[圖7(b)]，經(jīng)胰蛋白酶消化形成肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用MASCOT質(zhì)譜匹配軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得肽段的序列。結(jié)果顯示，檢測到兩個(gè)多肽片段分別能夠與蛋白數(shù)據(jù)庫中三疣梭子蟹IAG相匹配，分別為B鏈的SFSSVCLTYK和A鏈的NVNGYDECCPQSTK，確定表達(dá)產(chǎn)物為三疣梭子蟹IAG重組融合蛋白(圖8)。

(a)M：蛋白預(yù)染Marker；泳道1～4：分別為誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、破碎后上清液、破碎后沉淀。(b)M：蛋白預(yù)染Marker；1：濃縮純化后蛋白。(c)M：蛋白預(yù)染Marker；泳道1～4：分別為誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后菌液、破碎上清液、破碎沉淀Western Blot印跡。圖7 IAG重組融合蛋白純化及Western Blot分析Figure 7 Purification and Western Blot analysis of IAG recombinant fusion protein

圖8 IAG重組融合蛋白質(zhì)譜鑒定Figure 8 Mass spectrum of the IAG recombinant fusion protein

3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于遺傳背景清楚，容易培養(yǎng)、有大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體，使之成為人們克隆載體的主要菌株[19]。研究基于基因工程與原核表達(dá)的方法利用大腸桿菌BL21(DE3)及Rosetta(DE3)菌株成功表達(dá)出三疣梭子蟹IAG重組融合蛋白。對表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同的表達(dá)載體跟菌株中的表達(dá)情況及表達(dá)量存在差別，這與人C反應(yīng)蛋白表達(dá)情況一致[20]。

pET-28a-sumo-IAG表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)及Rosetta(DE3)菌株中均有可見表達(dá)，而pET-22b-IAG和pET-28a-IAG未見表達(dá)或表達(dá)量過低未檢測到，根據(jù)馬超[21]的報(bào)道可能是不同的表達(dá)載體所具有的蛋白質(zhì)標(biāo)簽不同所造成的。pET-28a-sumo-IAG表達(dá)載體能夠成功誘導(dǎo)表達(dá)出重組融合蛋白，可能因?yàn)樵撦d體增添了小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)，作為分子伴侶防止中間產(chǎn)物聚集，通過對靶細(xì)胞的類伴侶效應(yīng)協(xié)助折疊來提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平[22]。同時(shí)，因其固有的伴侶特性，它具有減少蛋白質(zhì)水解降解和簡化純化的巨大優(yōu)勢[23]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同樣的表達(dá)載體，相同的誘導(dǎo)條件，BL21菌株中目的蛋白的表達(dá)量也不同于Rosetta(DE3)，這可能是由于Rosetta(DE3)宿主菌是從BL21衍生來的，該菌株有一個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充大腸桿菌稀有密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNA，可增強(qiáng)真核蛋白表達(dá)[24]，這也表示當(dāng)要表達(dá)的目的蛋白中含有稀有密碼子較多時(shí)，可考慮Rosetta(DE3)這種菌株。

對成功誘導(dǎo)表達(dá)Rosetta-pET-28a-sumo-IAG進(jìn)行培養(yǎng)溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)重組菌株的最佳誘導(dǎo)溫度為16 ℃，低溫能夠減緩蛋白的合成、折疊，減少因蛋白質(zhì)翻譯速率遠(yuǎn)高于折疊速率形成不穩(wěn)定或者錯(cuò)誤折疊的空間構(gòu)象[25]。IPTG誘導(dǎo)終濃度從0～1.0 mmol/L梯度增加，目的蛋白的表達(dá)量逐漸升高到0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，隨后開始降低，認(rèn)為誘導(dǎo)劑最適濃度為0.6 mmol/L，IPTG濃度過高或者過低均會(huì)抑制表達(dá)[26]。另外誘導(dǎo)時(shí)間對表達(dá)量影響較大，添加誘導(dǎo)劑后重組融合蛋白開始表達(dá)，隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，表達(dá)量達(dá)到最高。低溫和較低的IPTG濃度確實(shí)使蛋白質(zhì)折疊明顯減慢，可溶性蛋白水平升高，此外，長時(shí)間的誘導(dǎo)也是必要的。蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定是基于Western Blot和ELISA傳統(tǒng)檢測方法基礎(chǔ)上的新興檢測技術(shù)，LC-MS/MS鑒定蛋白質(zhì)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中普遍應(yīng)用的方法[27]。

盡管將大腸桿菌表達(dá)的蛋白用于體內(nèi)時(shí)，具有缺乏翻譯后修飾、有內(nèi)毒素和重組蛋白空間構(gòu)象改變的缺點(diǎn)，但蛋白自然空間構(gòu)象對制備多克隆抗體血清并不起決定性作用[28]，故研究采用大腸桿菌Rosetta(DE3)來表達(dá)重組蛋白。研究結(jié)果對大量可溶性蛋白樣品的制備具有指導(dǎo)意義，也為后續(xù)制備多克隆抗體及進(jìn)一步在蛋白水平上研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了三疣梭子蟹IAG基因不同的原核表達(dá)載體pET-22b-IAG、pET-28a-IAG和pET-28a-sumo-IAG；16 ℃、IPTG濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)16 h后重組融合蛋白表達(dá)量最大，并能以可溶性形式分泌表達(dá)，最終純化得到濃度為0.95～1.17 mg/mL可溶性蛋白；經(jīng)過Western Blot分析及LC-MS/MS鑒定，pET-28a-sumo-IAG在Rosetta(DE3)中成功表達(dá)。