張武元，袁 波，曲 戈，孫周通

(中國科學院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308)

得益于分子生物學、生物信息學、合成生物學、蛋白質(zhì)工程與過程工程等學科及技術(shù)的快速發(fā)展，生物催化已成為一種在生物制藥、生物能源、食品飼料與日化用品等領(lǐng)域中廣泛使用的技術(shù)。生物催化可以改善化學反應(yīng)過程的可持續(xù)性，彌補化學催化在原子經(jīng)濟性、區(qū)域/立體選擇性、催化活性等方面的不足。當前用于生產(chǎn)化學品的方法過度依賴耗時、耗能和耗材的反應(yīng)中間體的分離及純化，導致大量三廢排放及生產(chǎn)成本的增加。因此，必須通過整合符合新舊12條綠色化學準則的合成步驟來建立更清潔環(huán)保的化學品合成路線。大自然使用一種優(yōu)雅而有效的策略，即利用光作為能量，并將其轉(zhuǎn)換為化學能，后者隨后被釋放出來以促進生物體的活動。因此，光在驅(qū)動及調(diào)節(jié)生物催化反應(yīng)方面的能力越來越受到重視。近些年，已報道在生物催化反應(yīng)中引入光能的人工光促酶催化(photobiocatalysis)的設(shè)計與應(yīng)用[1-2]。

光合作用是自然界存在最久遠、反應(yīng)類型最專一的復雜生物合成系統(tǒng)，能夠利用光能將CO2和H2O轉(zhuǎn)化為生命有機化合物，是生命得以延續(xù)的基礎(chǔ)反應(yīng)之一。師法自然并超越自然，基于人類社會與生命系統(tǒng)發(fā)展對新物質(zhì)合成的迫切需求，人工設(shè)計光促生物催化反應(yīng)順應(yīng)而生。已經(jīng)有多種天然或人工光敏劑被引入到生物催化反應(yīng)體系中，后者有望通過高效調(diào)控酶的活性來解決生物催化領(lǐng)域中長期存在的眾多技術(shù)問題。例如，通過設(shè)計利用光活性介體[如Ru (II)-二亞胺光敏劑、硫化鎘量子點等]建立光激發(fā)誘導的電子傳遞鏈體系，可直接將還原當量傳遞給P450酶的血紅素單元[3-4]。該方法省去了P450酶依賴的復雜電子傳遞鏈及較昂貴的還原態(tài)輔酶NAD(P)H，為提升酶催化效率和經(jīng)濟成本問題提供了新思路。近年研究較多的過氧合酶，其結(jié)合了P450酶的催化多功能性卻無須依賴輔酶及其再生循環(huán)體系，因而在催化有機化合物的氧化官能化反應(yīng)領(lǐng)域受到重視[5]。但是該酶對H2O2極其敏感，反應(yīng)體系中高濃度H2O2會引起血紅素氧化分解。因此，精確控制反應(yīng)體系中H2O2的濃度對過氧合酶的高效應(yīng)用至關(guān)重要[6]。利用TiO2、g-C3N4等光催化劑氧化水及甲醇等小分子化合物可控地為過氧合酶原位提供H2O2，可有效解決該酶對H2O2共底物敏感性問題[7-9]。此外，通過對天然光促酶的挖掘及定向設(shè)計改造，可實現(xiàn)多官能團分子的制備。普林斯頓大學的Hyster發(fā)現(xiàn)，黃素依賴的烯還原酶在藍綠光誘導下，躍遷到激發(fā)態(tài)的黃素可改變烯還原酶的催化功能，可對碳氫鍵進行選擇性活化，建立起自然條件難以催化的不對稱自由基環(huán)化反應(yīng)[10]。

綜上，人工光促酶催化在生物催化領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。近年也有多篇文獻綜述該技術(shù)在不同領(lǐng)域的進展[2,11-12]。本文主要選取近年典型的光促酶催化研究報道，旨在展示該技術(shù)在生物合成方面的最新應(yīng)用和有待解決的技術(shù)瓶頸，并激發(fā)化學家的興趣，為進一步開發(fā)基于光促酶催化的綠色生物催化技術(shù)提供參考。

1 光促酶催化的發(fā)展歷程

1880年首次發(fā)現(xiàn)葉綠體是光合作用進行的場所，并對其作用機制及能量傳遞路徑進行了一系列研究[13]。此后，光與生命交集方面的研究熱情從未停止過。1949年首次發(fā)現(xiàn)細菌被紫外光殺死后可在可見光的誘導下恢復活性，由此揭開了DNA光解酶發(fā)現(xiàn)的序幕[13]。該方面的研究在2015年獲得諾貝爾化學獎。20世紀末，受光催化技術(shù)的啟發(fā)，生物學家通過巧妙的設(shè)計成功地將光催化氧化還原釋放的電子傳遞給P450酶或烯還原酶[3,14]，大幅度簡化了冗長電子傳遞路徑。已有報道，先后設(shè)計多項級聯(lián)光催化與酶催化進行生物合成的例子[2,12]。不僅如此，近年來由于酶定向進化技術(shù)的巨大進步，可對含有FMN、FAD等輔酶的天然酶進行智能設(shè)計改造[10,15]，光誘導下進行的系列反應(yīng)極大地拓展了合成化學家的視野和生物合成的邊界。

當前，人工設(shè)計光促酶催化的研究在生物合成中扮演著重要的角色，通過在酶促反應(yīng)中以一定的方式引入光信號，使其朝著預(yù)定的目標進行。圖1為近15年來有關(guān)人工光促酶催化研究的論文發(fā)表情況。光促酶催化中光以兩種方式參與：(1)在體系中引入額外的光敏劑/光催化劑(本文統(tǒng)稱光催化元件)，在光激發(fā)下引發(fā)的化學反應(yīng)與酶形成級聯(lián)催化模式，反應(yīng)過程產(chǎn)生的過渡態(tài)產(chǎn)物直接被后續(xù)的酶催化反應(yīng)加以利用轉(zhuǎn)化；(2)許多天然酶含有可對光響應(yīng)的輔酶，如FAD、FMN、NAD(P)H等，在光的激發(fā)下，輔酶可改變原有催化模式，同時在酶三維結(jié)構(gòu)的協(xié)同下，形成一系列新型的反應(yīng)路徑。本文將這類天然酶統(tǒng)稱為光促酶(photoenzyme，也有文獻中稱其光能酶)。為方便討論，下文分別將這兩類催化方式定義為級聯(lián)型光促酶催化和誘導型光促酶催化，并著重就光促酶催化在生物合成中的最新應(yīng)用展開評述。

圖1 2005—2020年有關(guān)光促酶催化論文發(fā)表數(shù)量(數(shù)據(jù)來自Web of Science)Figure 1 The number of published papers on photobiocatalysis from 2005 to 2020 (Data from Web of Science)

(a)級聯(lián)型光促酶催化；(b)誘導型光促酶催化。 圖2 光促酶催化的兩種方式 Figure 2 Two types of photobiocatalytic approaches

1.1 人工光促酶催化原理

在第一類級聯(lián)型光促酶催化中，人工光催化元件通過吸收可見光或者紫外光觸發(fā)相鄰分子的氧化還原狀態(tài)。一般而言，光催化元件激發(fā)的電子可通過兩種方式與酶偶聯(lián)：(1)通過還原型輔因子和H2O2的光化學再生或者通過介體(Mediator)向氧化還原酶間接轉(zhuǎn)移[圖2(a)-Path I]；(2)光激發(fā)電子直接轉(zhuǎn)移到含有輔酶的氧化還原中心來激活氧化還原酶[圖2(a)-Path Ⅱ]。后者可避免額外光催化再生介體的參與，因此催化過程更加簡單、經(jīng)濟和環(huán)境友好，可最大限度地減少反應(yīng)介體對底物的干擾。但是，直接光化學活化的酶往往由于光激發(fā)電子轉(zhuǎn)移效率低以及副反應(yīng)多導致總轉(zhuǎn)化數(shù)(total turnover number,TTN)和轉(zhuǎn)化頻率(turnover frequency,TOF)相對較低。此外，該光促酶催化過程還面臨活性氧自由基的產(chǎn)生和光催化劑被漂白和分解等問題[11,16]。

在第二類誘導型光促酶催化中，光直接激發(fā)含有輔酶FAD、FMN、NAD(P)H等的天然酶，無需引入額外的光催化元件。在光誘導下，輔酶直接從基態(tài)轉(zhuǎn)為激發(fā)態(tài)[圖2(b)]。以輔酶FMN作為活性中心的氧化還原酶催化反應(yīng)為例，底物首先通過氫鍵作用與酶活性中心的組氨酸(histidine,His)等功能基團結(jié)合，同時氧化態(tài)FMN得到一個氫原子變成還原型FMNH-并且與底物毗鄰；隨后在光誘導下得到黃素自由基(FMNH·)和以底物為中心的自由基(通常以脫鹵素為主)。該歷程中，底物自由基直接通過氫原子轉(zhuǎn)移(hydrogen atom transfer,HAT)，或通過分子內(nèi)/雙分子間自由基加成反應(yīng)(radical addition reaction,RAR)得到相應(yīng)的產(chǎn)物和氧化態(tài)FMN；最后通過底物交換和還原型FMNH-回到靜息狀態(tài)，進入下一個循環(huán)[17]。以輔酶FAD和NAD(P)H為活性中心的氧化還原酶在光直接誘導型光促酶催化反應(yīng)中具有相似的催化機理[10,15]。

1.2 人工光促酶催化設(shè)計中的光催化元件

有機染料[18](如卟啉、氧雜蒽衍生物、釕和銥絡(luò)合物等)和一些納米材料(如量子點、碳基納米材料和二氧化鈦等)已被廣泛用作光催化元件，并由此設(shè)計了多種級聯(lián)型光促酶催化方法。圖3歸納了已報道的光催化元件及與之相伴的犧牲型電子供體和氧化還原介體。

圖3 光促酶體系中常用的光催化元件、犧牲電子供體和氧化還原介體Figure 3 Structures of photocatalysts,sacrificial electron donors and redox mediators commonly used for photobiocatalysis

受天然葉綠素分子中卟啉結(jié)構(gòu)的特殊光化學性質(zhì)啟發(fā)，研究者試圖設(shè)計基于卟啉結(jié)構(gòu)的光催化元件[19]。例如：金屬卟啉(如鋅卟啉)在三重激發(fā)態(tài)下具有相對長的壽命，已被廣泛用于酶催化反應(yīng)體系[20-21]。雜蒽(如曙紅Y和孟加拉玫瑰紅等)以及藏紅等屬于低成本、非金屬、水溶性的化合物，可吸收紫外或可見光。其結(jié)構(gòu)易被功能化修飾以改進其光化學性質(zhì)，產(chǎn)生具有單線態(tài)-三線態(tài)躍遷的光激發(fā)電子[22-23]。同理，可通過改變釕(II)和銥(III)配合物的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對其HOMO和LOMO能級調(diào)節(jié)，得到理想的光電化學性能[19]。黃素(如RF、FMN、FAD)的結(jié)構(gòu)中含有芳香異咯嗪結(jié)構(gòu)，具有獨特的光化學和氧化還原性質(zhì)，被廣泛用作光促酶催化中的光催化元件。黃素在光照條件下可以作為三重態(tài)光敏劑通過系間穿越到達三重激發(fā)態(tài)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移；而由于本身的共軛結(jié)構(gòu)和較寬的氧化還原電位可有效發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。這也是誘導型光促酶催化可以順利實現(xiàn)的主要原因[24-25]。但是，上述有機光元件存在的普遍局限性是光漂白的發(fā)生，導致其光活性壽命較短[26]。

與有機光敏劑相比，無機納米光催化劑在光照條件下的光漂白作用則小得多。本文主要總結(jié)幾類使用頻率較高的無機光催化元件。量子點(quantum dots,QD)是一種半導體納米粒子，具有獨特的光物理性質(zhì)。通過精確控制QD的形狀、尺寸和結(jié)構(gòu)等來調(diào)控其光學性能，也可以對QD表面進行功能化改性使其更適應(yīng)特定的生物酶催化環(huán)境[27-28]。二氧化鈦(TiO2)禁帶寬度高達3.2 eV，僅在紫外光下具有光化學響應(yīng)，應(yīng)用受限。通常通過對其進行摻雜改性來抑制光生電子與空穴的復合，降低TiO2禁帶寬度實現(xiàn)可見光區(qū)域的光響應(yīng)[29-30]。釩酸鉍(BiVO4)具有較好的可見光響應(yīng)性能，其單斜相的禁帶寬度僅為2.4 eV，吸收光譜500 nm以上，化學穩(wěn)定性高且安全無毒，在光促酶催化領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[31]。碳基納米材料如氮化碳(graphitic carbon nitride,g-C3N4)和碳量子點(carbon dot,CD)由于不含有毒重金屬，生物相容性高且環(huán)境友好，以及出色及可調(diào)的光學和電化學性能在級聯(lián)型光促酶催化中具有較大應(yīng)用潛能[32-33]。但是，g-C3N4與氧化還原伴侶的界面相互作用較弱，在水相中的分散性較低[34]。相比之下，CD通常含豐富的羧基，水溶性好，容易通過共價鍵實現(xiàn)表面功能化[35]。

光促酶催化體系中經(jīng)常需要使用電子犧牲劑再生光催化元件或使光誘導產(chǎn)生的空穴淬滅。常用的犧牲劑有叔胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、有機酸(如甲酸、抗壞血酸)、含硫化合物和兩性離子緩沖液等[11,36]。但多數(shù)犧牲劑的原子經(jīng)濟性較低，且伴隨一定的副反應(yīng)。因此，從原子經(jīng)濟性和環(huán)境方面考量，光促酶催化的理想目標是建立以甲醇作為犧牲劑的徹底氧化途徑，或利用水(即反應(yīng)溶劑)直接作為電子源[37]。

當光激發(fā)電子不能直接從光催化元件傳遞到酶活性中心時，介體的引入至關(guān)重要。后者在光催化元件和氧化還原酶之間充當一個遠程且自由擴散的穿梭體角色。甲基紫精(MV2+)是常見的介體之一，但其毒性阻礙了它的廣泛應(yīng)用。目前，Cp*Rh絡(luò)合物、天然黃素FMN等常作為替代電子傳遞介體使用[38-39]。

1.3 人工光促酶催化設(shè)計中的酶元件

表1 光促酶級聯(lián)反應(yīng)中使用的酶類Table 1 Enzymes used in the cascaded photobiocatalysis

2 級聯(lián)型光促酶催化體系的設(shè)計

目前，具有高活性和魯棒性的級聯(lián)型光促酶催化體系主要應(yīng)用上述光催化元件和酶的不同組合。由于光催化反應(yīng)通常在室溫下進行，并可通過光激發(fā)電子和能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生在水相中穩(wěn)定且與生物酶兼容的中間體，這使級聯(lián)型光促酶催化成為可能[16]。級聯(lián)方式主要有3種：順序、并發(fā)和協(xié)同(圖 4)。順序反應(yīng)中酶催化和光催化反應(yīng)條件不兼容，在進行多步反應(yīng)時需要改變反應(yīng)條件；而并發(fā)以及協(xié)同反應(yīng)過程中，酶和光催化反應(yīng)可以在同一條件下反應(yīng)，通常采用“一鍋法”的級聯(lián)方式[2,48，52]。

圖4 級聯(lián)型光促酶催化的3種反應(yīng)方式Figure 4 Three pathways of cascading photocatalysis with enzymatic

在所有反應(yīng)方式中，利用光催化元件為氧化還原酶提供氧化還原當量[NAD(P)H、FMN或者FAD]的研究最為廣泛。例如，Choudhury等[40]設(shè)計了可見光驅(qū)動NAD(P)H再生策略來合成手性醇。在該方法中，以CCG-BO-DIPY為光催化元件，[Cp*Rh(bpy)Cl]Cl作為介體，采用“一鍋法”進行光化學再生NAD(P)H來激活酮還原酶(ketoreductases,KREDs)還原多類型酮底物，獲得了一系列手性醇產(chǎn)物，e.e.值達95%以上。同樣，利用光催化元件輔助NADPH的循環(huán)，可為P450酶提供氧化還原當量，從而為P450酶選擇性氧化反應(yīng)提供了新思路。Lee等[18]實現(xiàn)可見光再生NAD(P)H來驅(qū)動胞外P450 BM3單加氧酶的脫烷基反應(yīng)，通過使用曙紅Y、電子犧牲供體TEOA及介體Cp*Rh(bpy)H2O實現(xiàn)NAD(P)H的再生。Mifsud等[14]使用Au摻雜的TiO2作為光催化劑，將水(同時作為反應(yīng)溶劑)氧化產(chǎn)生的電子直接輸送給OYE酶中還原型輔因子FMN，在可見光下反應(yīng)6 h后，成功觀察到茶香酮的還原(轉(zhuǎn)化率為66%，e.e.為86%),具體見圖5。

圖5 Au-TiO2光催化劑與OYEs酶級聯(lián)催化共軛CC雙鍵的不對稱還原Figure 5 Asymmetric reduction of conjugated CC bonds catalyzed by OYEs cascaded with Au-TiO2

H2O2作為一種還原態(tài)的氧供體，可以繞開氧化還原時復雜的電子傳遞鏈。過氧化物酶、水解酶、過氧合酶等均可使用H2O2作為共底物。但是，高濃度的H2O2會導致這類氧化酶的活性單元被氧化分解[6]。例如，從富馬熱酵母中提取的氯過氧化物酶(chloroperoxidase,CPO)在含有50 μmol/L H2O2的磷酸鹽緩沖溶液(體積分數(shù)30%t-BuOH)體系中半衰期約為38 min[53]?？梢姡琀2O2的濃度必須保持在最佳水平以維持H2O2依賴氧化酶的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。由于簡單和廉價易得，葡萄糖氧化酶體系再生H2O2較為常用。但該方法的主要缺點(尤其是大規(guī)模應(yīng)用)是較低的原子利用效率和反應(yīng)中葡糖酸內(nèi)酯(或相應(yīng)的葡萄糖酸)的化學計量累積[54]?；诖?，光催化原位生成H2O2的方法由于其操作穩(wěn)定性高、底物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)勢已成為一個重點研究方向。

Hollmann課題組設(shè)計了系列H2O2原位生成體系(圖6)。利用黃素作為光催化元件，用電子供體(EDTA)對黃素進行光誘導，激發(fā)態(tài)的黃素與反應(yīng)體系中存在的O2迅速自發(fā)反應(yīng)生成H2O2，該體系可被應(yīng)用于過氧合酶催化的羥基化、環(huán)氧化、磺氧化等反應(yīng)[45]；利用Au-TiO2無機光催化劑，創(chuàng)新性地提出并證實了理論上原子經(jīng)濟性100%的光催化H2O氧化原位生成H2O2，用于AaeUPO酶催化的C—H鍵選擇性羥化反應(yīng)[8]；最近，水的光催化氧化原位生成H2O2進一步被拓展到輻射化學領(lǐng)域，放射性Co-60輻射或U-235(γ-射線)分解H2O并原位生成H2O2，后者可級聯(lián)AaeUPO酶選擇性催化乙苯生成(R)-苯乙醇等一系列氧官能化反應(yīng)[55]。

圖6 3種光催化劑催化原位生成H2O2驅(qū)動AaeUPO酶Figure 6 Three photocatalysts used for n situ regeneration of H2O2 to drive AaeUPO

需要指出的是，H2O因其極為惰性(H2O的氧化能壘高達474.61 kJ/mol)導致氧化反應(yīng)極其困難，使反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率很低。而小分子醇如甲醇，在承擔犧牲劑角色被徹底氧化的同時，也是出色的氫氧自由基捕獲劑，可有效降低自由基對過氧合酶血紅素的氧化。

上述級聯(lián)光促酶催化可有效簡化P450酶電子傳遞鏈，提升過氧化酶的穩(wěn)定性。除此之外，可設(shè)計多種光催化反應(yīng)和酶催化級聯(lián)組合，即反應(yīng)底物首先被光催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)中間體，后者作為酶的底物在接下來的過程中被直接轉(zhuǎn)化。這種巧妙地結(jié)合簡化了有機合成反應(yīng)步驟，為不對稱有機合成新反應(yīng)途徑的開發(fā)提供了很好的思路。

(a)合成1,3-巰基醇產(chǎn)物；(b)不對稱合成2,2-雙取代吲哚-3-酮；(c)CC鍵的不對稱還原。圖7 光催化反應(yīng)與酶催化反應(yīng)級聯(lián)實例Figure 7 Examples of cascade photocatalytic and enzymatic reactions

Guo等[49]首次采用級聯(lián)型光促酶催化方式設(shè)計了一種從環(huán)亞胺出發(fā)不對稱合成R型環(huán)胺的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)體系。首先，使用水溶性銥催化劑[Na3Ir(sppy)3]將環(huán)亞胺還原為α-氨基烷基自由基，在抗壞血酸還原劑(AscH2)作用下，α-氨基烷基自由基通過HAT得到外消旋的環(huán)胺混合物。隨后，通過單胺氧化酶(MAO-N-9)將S型環(huán)胺再氧化為環(huán)亞胺，如此進行循環(huán)。在連續(xù)光照射下，反應(yīng)體系最終得到R型單一對映體。需注意的是，由于光催化反應(yīng)和酶催化反應(yīng)在細胞裂解液中相互干擾，MAO-N-9使用了大腸桿菌全細胞進行催化轉(zhuǎn)化。最近，本課題組[58]采用水溶性的蒽醌催化劑，在緩沖液中順利實現(xiàn)“一鍋法”光促酶催化級聯(lián)反應(yīng)，可與多達11種酶級聯(lián)合成光學純的化合物。要指出的是，光誘導下產(chǎn)生的高活性氧和自由基會成為光促酶級聯(lián)催化中抑制酶的主要因素，所以上述反應(yīng)多采用“一鍋兩步法”。目前多數(shù)級聯(lián)型光促酶催化反應(yīng)以“一鍋法”進行，無需進行中間產(chǎn)物分離，具有降低物耗和能耗、提高反應(yīng)效率和綠色環(huán)保等特點。然而，由于光催化元件與酶通常在不同的介質(zhì)和溫度下工作，所以將酶與光催化劑以“一鍋法”方式反應(yīng)仍然具有挑戰(zhàn)性。

3 誘導型光促酶催化體系的設(shè)計

第二種誘導型光促酶催化在反應(yīng)過程中無需引入額外的光催化元件。目前已發(fā)現(xiàn)4類天然光促酶，即光合系統(tǒng)、光裂合酶、原葉綠素酸酯氧化還原酶以及脂肪酸光脫羧酶。光合作用系統(tǒng)作為地球上最重要的生物過程之一，由光系統(tǒng)I(PSI)和光系統(tǒng)II(PSII)共同促成了光合作用過程[59-60];光裂合酶是一種DNA修復酶，利用可見光修復被紫外線破壞的DNA[61-62];原葉綠素酸酯還原酶是一種依賴NADPH的光促酶，通過將原葉綠素轉(zhuǎn)化為葉綠素a參與葉綠素的合成[63]。上述3類光促酶表明，光可以參與復雜的酶促反應(yīng)。然而，上述酶在天然產(chǎn)物合成過程中的高度專一性限制了其在化學合成中的應(yīng)用。在小球藻(ChlorellavariabilisNC64A)中提取純化的第4類脂肪酸光脫羧酶(fatty acidphotodecarboxylase,CvFAP)則在化學合成中表現(xiàn)出巨大的潛力。FAP是一種藍光-光促酶，可催化一系列游離脂肪酸的脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的烷烴和烯烴，且可以對體系反應(yīng)時間進行精確控制[64](圖8)。藍光是誘導該酶活性中心FAD轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)自由基并進行催化脫羧的唯一誘因。其中C16和C17脂肪酸的脫羧效率最高，轉(zhuǎn)化率達到96%[65-66]。

圖8 CvFAP酶在藍光下進行脫羧反應(yīng)Figure 8 Decarboxylation catalyzed by CvFAP under blue light

為解決該光促酶只對長鏈脂肪酸具有活性的問題，可采用添加誘餌分子來提高對小分子羧酸的脫羧反應(yīng)，實現(xiàn)H2、甲烷、烯烴等的制備，該策略可大幅度拓展光促酶的合成范圍[67]。此外，與油酸水合酶級聯(lián)(圖9)，可實現(xiàn)多種光學純高級脂肪仲醇的合成，是替代傳統(tǒng)格氏試劑法合成脂肪醇的一類有競爭力的綠色合成方法[68]。

圖9 CvFAP與LrOH酶級聯(lián)催化不飽和脂肪酸合成手性脂肪仲醇Figure 9 Synthesis of chiral secondary fatty alcohols from unsaturated fatty acids catalyzed by cascading CvFAP and LrOH

如前所述，除自然界存在的光促酶外，許多經(jīng)典的天然酶含有可對光響應(yīng)的輔酶，如NAD(P)H、FAD、FMN等。在光激發(fā)下，輔酶形成還原性較強的自由基以改變原有的催化路徑，實現(xiàn)新的催化過程。例如，NAD(P)H由于結(jié)構(gòu)中含有1,4-二氫吡啶具有氧化還原活性，可被可見光直接激活使其從基態(tài)的弱單電子還原劑轉(zhuǎn)變?yōu)閺妴坞娮舆€原劑，在光激發(fā)下還原一系列官能團[69]。Emmanuel等[15]發(fā)現(xiàn)，從羅爾斯頓菌和乳酸菌中提取出來的醇脫氫酶(RasADH和LKADH)在藍光的激發(fā)下可作為自由基引發(fā)劑以及手性氫源(460 nm)，將外消旋α-鹵內(nèi)酯不對稱轉(zhuǎn)化為脫鹵內(nèi)酯，轉(zhuǎn)化率高達95%，產(chǎn)率為81%，e.e.值達到96%[圖10(a)]。最近，該課題組又探索了黃素依賴的ER酶在光誘導下形成黃素自由基，實現(xiàn)了非天然條件下的立體選擇性自由基環(huán)化反應(yīng)。該反應(yīng)以含烯基的α-氯酰胺作為底物，可選擇性合成5-8元環(huán)內(nèi)酰胺。其底物可包含多類型官能團，并可實現(xiàn)克級合成。鑒于內(nèi)酰胺類化合物在藥物合成中的突出作用，該反應(yīng)具有重要價值[圖10(b)][10]。以上兩種光促酶催化反應(yīng)都發(fā)生在分子內(nèi)，而Huang等[17]最近設(shè)計了利用可見光直接誘導ER酶催化分子間的交叉偶聯(lián)反應(yīng)。通過使用端烯烴和α-鹵化物羰基化合物實現(xiàn)自由基加氫-烷基化偶聯(lián)反應(yīng)，合成一系列γ-手性羰基化合物，具有良好的產(chǎn)率(高達99%)和對映選擇性(e.e.值達到99%)，突破了化學法催化的極限[圖10(c)]。該反應(yīng)中的關(guān)鍵步驟仍然是可見光誘導黃素自由基和底物自由基的形成。

(a)光誘導醇脫氫酶進行脫鹵內(nèi)酯反應(yīng)；(b)光誘導烯還原酶進行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng);(c)光誘導烯還原酶進行分子間交叉偶聯(lián)反應(yīng)。圖10 誘導型光促酶催化自由基的選擇性生成及利用Figure 10 Selective generation and use of free radicals catalyzed by induced photobiocatalysis

4 光促酶催化在生物合成中的應(yīng)用

20世紀末，生物催化的應(yīng)用主要集中于合成或拆分光學活性中間體，并逐漸發(fā)展成為一種廣泛適用于化學合成和制造的技術(shù)。但生物催化技術(shù)面臨的一個長期挑戰(zhàn)是酶功能開發(fā)不足。為此，酶源挖掘及酶工程等已成為突破上述瓶頸的手段。而光促酶催化技術(shù)已被證明是一種開發(fā)酶功能的新途徑。除了將光催化和酶催化反應(yīng)進行級聯(lián)組合開發(fā)新的生物催化途徑外，也可通過結(jié)合酶的定向進化改造，有力地促進天然酶的非天然催化范圍，在新分子合成和新化學開發(fā)方面具有重要潛力。浙江大學吳起等[70]利用迭代飽和突變，對脂肪酸光促脫羧酶的殘基Y466與核黃素光催化單元周圍的關(guān)鍵區(qū)域氨基酸位點進行改造，成功實現(xiàn)了α-羥化脂肪酸和少數(shù)氨基酸的動力學拆分，獲得的光學純羥化脂肪酸可作為砌塊用于抗癌藥或神經(jīng)中樞抑制器的合成。采用類似的策略，改造后的光促脫羧酶可催化動力學拆分外消旋草銨膦，首次實現(xiàn)了酶催化重要農(nóng)藥L-草銨膦的克級制備[71]。而上述拆分反應(yīng)在自然酶催化過程活性極低或無法發(fā)生。可見，光促酶催化在生物合成中極具開發(fā)潛力。表2列舉了近幾年一些典型的人工設(shè)計的光促酶級聯(lián)催化應(yīng)用實例，以便為手性及區(qū)域選擇性的化學合成提供參考。

表2 光促酶催化在生物合成中的應(yīng)用實例Table 2 Examples using photobiocatalysis in biosynthesis

5 小結(jié)與展望

光促酶催化是一種迅速發(fā)展的多學科交叉生物合成技術(shù)，在新分子合成及新化學開發(fā)方面顯示出廣闊的前景。但是，在光促酶催化領(lǐng)域面臨多個亟待解決的問題。首先，在第一類級聯(lián)型光促酶催化方式中，反應(yīng)體系多是簡單地將光敏劑、電子媒介、輔酶等與酶催化劑按照一定的配比組合。在該情況下，激發(fā)電子的隨機傳遞和轉(zhuǎn)移將顯著影響光能的利用效率。因此，可設(shè)計光催化元件與酶元件的集成體系，構(gòu)建有效的光-酶催化界面以更高效地促進電子在兩個催化元件間的傳遞。其次，光催化元件的催化活性是影響光促酶催化效率的限制性因素。因此，不斷地改進或設(shè)計新型的高活性光催化元件對提升光促酶催化的效率和應(yīng)用范圍至關(guān)重要。對光催化裝置的設(shè)計優(yōu)化以及對酶元件與光催化元件的共固定，均可顯著提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和酶的穩(wěn)定性。最后，近年圍繞烯還原酶的設(shè)計改造工作雖然已充分展示了酶改造的強大作用，但是在第二類誘導型光促酶催化方式中，反應(yīng)多在無氧條件下進行，其操作復雜性在一定程度上限制了其在合成化學中的潛力。因此，酶定向進化技術(shù)及結(jié)合機器學習的酶智能設(shè)計與改造方法有望極大地推動光促酶催化技術(shù)的發(fā)展[80-84]。未來的酶定向進化不僅要開發(fā)光促酶的新功能，提升光促酶的催化效率、區(qū)域及立體選擇性、熱穩(wěn)定性、底物普適性等，還要致力于獲取無需在隔絕氧氣條件下(如改變酶活性孔道與氧氣的結(jié)合能力)可進行催化反應(yīng)的人工酶。

綜上所述，隨著上述挑戰(zhàn)的解決，光促酶催化技術(shù)在化工、醫(yī)藥、農(nóng)藥等合成領(lǐng)域的應(yīng)用將會不斷拓展，這必將有力促進不對稱催化合成和綠色生物制造領(lǐng)域的高質(zhì)量發(fā)展。