李曉莉，陶 玲，代梨梨，彭 亮，李 谷

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223）

浮游微藻在池塘養(yǎng)殖中具有舉足輕重的作用，對于維持池塘生態(tài)系統(tǒng)的正常功能、穩(wěn)定池塘環(huán)境十分重要。建立優(yōu)良的藻相一直是水產(chǎn)科技工作者追求的目標(biāo)，優(yōu)良的藻相需要多種有益藻共存。小球藻 (Chlorella vulgaris) 為綠藻門單細(xì)胞藻類，以光合自養(yǎng)生長繁殖，分布極廣泛，是養(yǎng)殖水體中常見的有益藻類，近年的研究常把小球藻作為處理養(yǎng)殖尾水及調(diào)控養(yǎng)殖水體的重要藻種[1-2]。舟形藻(Navicula) 隸屬于硅藻門、羽紋硅藻綱，是一種分布廣泛的單細(xì)胞硅藻，因其易于生長、生物量較大，在海水養(yǎng)殖中是很多珍貴水生動物的天然餌料[3-5]，在淡水養(yǎng)殖中，舟形藻也因易被濾食性魚類攝食和消化而有利于魚類產(chǎn)卵率和生長率的提高[6-7]。小球藻和舟形藻作為養(yǎng)殖中的有益藻，能否共同成為池塘藻相中的優(yōu)勢種、其相互之間的競爭關(guān)系以及影響因素等研究尚未見報道。

種間競爭是2種或以上生物共同利用同一資源而產(chǎn)生的相互作用，研究其機(jī)理有助于進(jìn)一步了解競爭生物的生長及抑制規(guī)律，可用來調(diào)控生物的生長和繁殖，進(jìn)行有害生物的防治和有益生物的共培養(yǎng)利用[8]。溫度、細(xì)胞起始密度比是影響藻類生長和競爭的重要因素[9-10]，其中，溫度通過改變細(xì)胞膜流動性、脂質(zhì)組成和酶活性對藻類產(chǎn)生影響；初始藻細(xì)胞密度通過產(chǎn)生的化感物質(zhì)數(shù)量和有限營養(yǎng)物質(zhì)占比，對藻類競爭表現(xiàn)出直接或間接影響[11-12]。本文研究了不同溫度和起始密度比對小皮舟形藻(N. pelliculosa) 和小球藻生長和競爭的影響，為利用種間競爭進(jìn)行有益微藻共培養(yǎng)和構(gòu)建池塘優(yōu)良藻相提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需小皮舟形藻 (FACHB-1709) 和小球藻(FACHB-1458) 均購自中國科學(xué)院水生生物研究所。培養(yǎng)基為BG11與CSI混合培養(yǎng)基 (體積比為1∶1)。將藻種接種到無菌培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度 3 000 lx，光周期 12 L∶12 D。藻種經(jīng)擴(kuò)培至所需生物量后，搖勻并計(jì)數(shù)，供實(shí)驗(yàn)接種使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為單種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。1) 單種培養(yǎng)：將小皮舟形藻和小球藻分別接入預(yù)先裝有滅菌培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)；2) 混合培養(yǎng)：將小皮舟形藻和小球藻按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的密度比接入同樣處理的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個平行。不同培養(yǎng)溫度和起始密度比見表1。培養(yǎng)條件與藻種擴(kuò)培條件一致。每3 h搖晃三角瓶，每4 d更換30%新鮮培養(yǎng)基。

表1 各處理組藻種接種數(shù)量和溫度設(shè)置Table 1 Inoculation quantity of each algae and setting of temperature

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)

自接種之日起，每2 d在同一時間取樣0.1 mL，滴加于浮游植物計(jì)數(shù)框中，置于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。取樣在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)整理

生長曲線擬合以邏輯斯諦方程擬合藻類的增長過程[13]。首先進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，以每個處理組的最大生物量 (Nmax) 作為各自的K估計(jì)值。應(yīng)用邏輯斯諦方程的對數(shù)形式 (式1)，以最小二乘法進(jìn)行回歸分析，獲得該方程的截距和斜率作為a和r的估計(jì)值。

式中：N為藻類生物量；K為最大生物量；r為內(nèi)稟增長率；t為培養(yǎng)時間。

競爭抑制參數(shù)的計(jì)算參考孟順龍等[14]、茅華等[15]的方法，利用Lotka-Volterra競爭模型的差分形式 [式 (2)、(3)]計(jì)算競爭抑制參數(shù)。

式中：Nnn和Ncn分別為混合培養(yǎng)中的小皮舟形藻和小球藻在時間 tn時的數(shù)量 (106個?mL?1)；Npn?2和Ncn?2分別為混合培養(yǎng)中小皮舟形藻和小球藻在時間 tn?2時的數(shù)量 (106個?mL?1)；rp和 rc分別為小皮舟形藻和小球藻的內(nèi)稟增長率 (由單種培養(yǎng)經(jīng)回歸計(jì)算獲得)；Kp和Kc分別為小皮舟形藻和小球藻的最大環(huán)境容量 (由單種培養(yǎng)獲得)；α和β分別為混合培養(yǎng)中小球藻對小皮舟形藻和小皮舟形藻對小球藻的競爭抑制參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Oneway ANOVA 檢驗(yàn)不同條件下各指標(biāo)顯著性差異；P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 小皮舟形藻在不同條件下的生長情況

小皮舟形藻的生長在低溫時呈先升高后降低的趨勢 (圖1)。10 ℃時細(xì)胞生長緩慢，除1∶10組外，基本在第6—第8天出現(xiàn)峰值后逐漸下降，然后再逐漸升高。20～30 ℃時細(xì)胞密度呈逐漸升高的趨勢，在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時達(dá)到峰值，35 ℃時小皮舟形藻不能生長，逐漸空泡化死亡，因此對35 ℃下各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)未做分析。無論是單種培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)，細(xì)胞峰值均隨溫度的升高逐漸增大 (表2)。單種培養(yǎng)峰值介于 0.31～0.50×106個?mL?1，混合培養(yǎng)組峰值介于 0.28～1.03×106個?mL?1。從細(xì)胞峰值來看，25～30 ℃更適合小皮舟形藻的增殖。

圖1 不同溫度和起始密度比條件下小皮舟形藻的密度變化Figure 1 Variation in cell densities of N. pelliculosa at different temperatures and initial cell density ratios

表2 小皮舟形藻在不同溫度和起始密度比條件下細(xì)胞峰值Table 2 Maximum cell density of N. pelliculosa at different temperatures and initial cell density ratios106 個·mL?1

混合培養(yǎng)中，10～25 ℃下1∶1和1∶0.1組與單種培養(yǎng)組無顯著差異 (P>0.05)，1∶10組在各個溫度下峰值均高于單種培養(yǎng)組，按照溫度從低到高依次為單種培養(yǎng)組的1.56、1.34、1.38和1.07倍，表明小球藻不會抑制小皮舟形藻的生長，且在一定范圍內(nèi)，其密度越大越能促進(jìn)小皮舟形藻的生長。30 ℃下，混合培養(yǎng)組的細(xì)胞峰值均顯著高于單種培養(yǎng)，1∶10、1∶1和1∶0.1組分別是單種培養(yǎng)組的1.68、2.08和2.05倍。

2.2 小球藻在不同條件下的生長情況

根據(jù)小球藻在各處理組的生長曲線和細(xì)胞峰值(圖2和表3) 可以看出，各處理組均表現(xiàn)出溫度對小球藻生長有顯著影響。10 ℃下，細(xì)胞幾乎停止生長，由于細(xì)胞分裂慣性，均在第2天達(dá)到峰值后逐漸下降。15 ℃下，小球藻生長較緩慢，單種培養(yǎng)組的峰值為 0.39×106個?mL?1；20～35 ℃ 下，小球藻細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞密度均在培養(yǎng)結(jié)束時達(dá)到最大，單種培養(yǎng)條件下細(xì)胞峰值依次為4.52×106、5.45×106、10.00×106、14.15×106個?mL?1，從細(xì)胞峰值來看，35 ℃更適合小球藻的增殖。

表3 小球藻在不同溫度和起始密度比條件下的細(xì)胞峰值Table 3 Maximum cell density of C. vulgaris at different temperatures and initial cell density ratios106 個·mL?1

圖2 不同溫度和起始濃度比條件下小球藻的密度變化Figure 2 Variation in cell densities of C. vulgaris at different temperatures and initial cell density ratios

混合培養(yǎng)中，1∶10組在各溫度下生長趨勢和峰值均優(yōu)于單種培養(yǎng)，在不適合小球藻生長的低溫情況下，也可以達(dá)到單種培養(yǎng)的14.57倍 (10 ℃下1∶10組)；1∶1組中，除15 ℃組細(xì)胞峰值顯著高于單種培養(yǎng) (P<0.05) 外，其余溫度組均與單種培養(yǎng)差異不顯著 (P>0.05)；1∶0.1組中細(xì)胞峰值均顯著低于單種培養(yǎng) (P<0.05)，說明在舟形藻共培養(yǎng)中，增大小球藻的接種密度能夠顯著增加其在混養(yǎng)體系中的細(xì)胞數(shù)量，反之則顯著降低其在混養(yǎng)體系中的細(xì)胞數(shù)量。

2.3 不同條件下小皮舟形藻和小球藻的生長速率

小皮舟形藻的生長速率隨溫度升高呈上升趨勢(圖3)，變化介于0.12～0.16；混合培養(yǎng)中小皮舟形藻的生長速率均高于單種培養(yǎng)，1∶1和1∶0.1組與單種培養(yǎng)組相比差異不顯著 (P>0.05)，1∶10組則顯著高于單種培養(yǎng)組 (P<0.05)，均值大小依次為1∶10組>1∶1組>1∶0.1組>單種培養(yǎng)組。在10～25 ℃下生長速率隨著混養(yǎng)體系中小球藻比重下降逐漸降低，介于0.12～0.20，30 ℃時各組無顯著差異 (P>0.05)。

圖3 不同條件下小皮舟形藻的生長速率Figure 3 Growth rate of N. pelliculosa under different conditions

小球藻的生長速率隨溫度升高顯著上升 (圖4)，35 ℃時達(dá)到最大值，變化介于0～0.35。混合培養(yǎng)中，隨著小球藻初始密度降低生長速率逐漸升高，1∶10組顯著低于單種培養(yǎng)組 (P<0.05)，1∶1組與單種培養(yǎng)組相比差異不顯著 (P>0.05)，1∶0.1組則顯著高于單種培養(yǎng)組 (P<0.05)。表明小球藻的起始接種密度可能是引起生長速率差異的原因。

圖4 不同條件下小球藻的生長速率Figure 4 Growth rates of C. vulgaris under different conditions

2.4 不同條件下小皮舟形藻和小球藻的競爭抑制參數(shù)

以單獨(dú)培養(yǎng)中擬合獲得的小皮舟形藻和小球藻種群環(huán)境容量 (K)、內(nèi)稟增長率 (r) 以及混合培養(yǎng)中拐點(diǎn)后的小皮舟形藻和小球藻細(xì)胞密度代入Lotka-Volterra競爭模型，計(jì)算各自的競爭抑制參數(shù) (α、β)。10 ℃ 下，小皮舟形藻生長極緩慢，小球藻則停止生長；35 ℃小皮舟形藻死亡。因此，10和35 ℃下，各實(shí)驗(yàn)組未進(jìn)行競爭參數(shù)計(jì)算。

不同溫度和起始密度下，α隨溫度升高而增大，變化范圍較小 (?4.66～0.06，表4)，說明小球藻的共存對小皮舟形藻的競爭抑制作用較小，且小球藻的存在可能會促進(jìn)小皮舟形藻的生長。隨著小球藻接種比例降低，α的絕對值逐漸減小，說明隨著小球藻密度降低，其對小皮舟形藻的影響逐漸減小。

表4 不同溫度和起始密度比條件下小皮舟形藻和小球藻之間的競爭抑制參數(shù)Table 4 Competition inhibition parameters of N. pelliculosa and C. vulgaris at different temperatures and initial cell density ratios

對小球藻而言，隨著溫度的升高，1∶1和1∶0.1組中，β呈逐漸升高趨勢，變化范圍較大(?3.89～26.92)，表明溫度對β有較大影響，這與小皮舟形藻的適宜生長溫度相吻合。1∶10組中β均為負(fù)值，說明在高密度小球藻的混養(yǎng)體系中，小皮舟形藻對小球藻的生長可能起促進(jìn)作用。β隨小皮舟形藻比重升高逐漸增大，均值分別為?7.26、3.67和10.18，說明起始密度比對β有較大影響。

3 討論

3.1 溫度對2種微藻生長和競爭的影響

環(huán)境變化是藻類季節(jié)性演替最主要的影響因子，某些特殊條件 (如低溫、光照改變) 導(dǎo)致一些物種不適應(yīng)，物種發(fā)生更替，適應(yīng)環(huán)境的物種占據(jù)空余出來的資源空間而大量繁殖[16]。因此，浮游藻類群落結(jié)構(gòu)一直是許多實(shí)驗(yàn)的研究對象，尤其是環(huán)境因子限制下的種群競爭與變化[17-18]。溫度是最重要的環(huán)境因子之一，水溫不僅影響藻類生命活動的活性、速率，還影響其對水中營養(yǎng)物的利用率和自身代謝率。多項(xiàng)研究表明，硅藻一般適宜較低的溫度，在低溫水體環(huán)境中有較強(qiáng)的競爭力[19]，張俊芳等[20]認(rèn)為湯浦水庫每年春季暴發(fā)以鏈狀彎殼藻(Achnanthidium catenatum) 和絲狀藍(lán)藻 (Filamentous cyanobacteria) 為絕對優(yōu)勢種的藻類水華，其中水溫是最為關(guān)鍵的驅(qū)動因子，由于春季水溫較低，適于鏈狀彎殼藻等硅藻的生長繁殖，當(dāng)水溫逐漸升高，喜高溫的絲狀藍(lán)藻則開始大量繁殖。本研究中，10～15 ℃下小皮舟形藻生長緩慢，20～30 ℃下生長良好，35 ℃下細(xì)胞逐漸空泡化至最后死亡。其中30 ℃下細(xì)胞生長峰值顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，筆者之前的研究顯示舟形藻適宜的生長溫度為30 ℃[21]，王卓等[22]的研究結(jié)果為25 ℃，與本研究結(jié)果基本一致。同時，30 ℃下的生長速率也顯著高于其他組。對小球藻而言，10 ℃下小球藻基本停止生長，15 ℃下生長較緩慢，25～35 ℃下生長迅速，單種培養(yǎng)中35 ℃細(xì)胞密度達(dá)到峰值，高出10 ℃單種培養(yǎng)組3個數(shù)量級，可見溫度對小球藻生長的影響非常顯著，35 ℃更適合小球藻的增殖。這與前人的報道基本一致[23-24]。

溫度對混合培養(yǎng)體系中藻間競爭關(guān)系也有顯著影響。研究表明，在環(huán)境發(fā)生改變?nèi)鐪囟让{迫等條件下，這種競爭和排斥會發(fā)生明顯變化，藻類相互間的競爭作用會因溫度等變化而進(jìn)一步強(qiáng)化或減弱[25]。本研究中，30 ℃下混合培養(yǎng)的小皮舟形藻細(xì)胞峰值均高于單種培養(yǎng)組，說明小球藻大量繁殖未對舟形藻生長造成競爭抑制，甚至可能因?yàn)樾∏蛟宓拇嬖诨蚍置谀撤N物質(zhì)促進(jìn)了小皮舟形藻的生長。而低溫情況下，小球藻生長緩慢，對小皮舟形藻的影響較小。有研究表明，當(dāng)溫度與藻類適宜溫度一致時，其競爭力較強(qiáng)[26]，本實(shí)驗(yàn)中β在15～30 ℃呈逐漸升高趨勢，這與其生長的適宜溫度一致。

3.2 種群密度對2種微藻生長和競爭的影響

種群密度是種群增長的重要參數(shù)，也是影響種間競爭的重要因素之一。魏杰等[27]在研究蛋白核小球藻 (C. pyrenoidosa, C) 和湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhanjiangensis, I) 的種間競爭中發(fā)現(xiàn)，ρ(C)∶ρ(I)=1∶4時，湛江等鞭金藻在競爭中占優(yōu)勢；ρ(C)∶ρ(I)=1∶1時，初期湛江等鞭金藻占競爭優(yōu)勢，隨蛋白核小球藻的迅速生長，后期蛋白核小球藻占競爭優(yōu)勢；ρ(C)∶ρ(I)=4∶1時，蛋白核小球藻占絕對競爭優(yōu)勢。劉瀟等[28]認(rèn)為在豐富的營養(yǎng)鹽環(huán)境中，種間競爭具有明顯的密度依賴性，根據(jù)初始細(xì)胞密度的不同，兩競爭物種既可以相互排斥，也可能共存。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度和起始密度比范圍內(nèi)，混養(yǎng)體系中的小皮舟形藻無論在細(xì)胞生長趨勢、細(xì)胞峰值還是生長速率方面，均未表現(xiàn)出小球藻對其競爭者所產(chǎn)生的不利影響，反而因?yàn)樾∏蛟宓墓泊娲龠M(jìn)了生長，且隨著小球藻密度增加，這種共存效應(yīng)愈發(fā)明顯，表現(xiàn)為密度依賴性共存。

對小球藻而言，1∶0.1組在不同溫度下，峰值均低于同溫度的單種培養(yǎng)組，1∶10組無論是細(xì)胞峰值還是生長趨勢均優(yōu)于其他處理組，說明提高小球藻的接種密度能夠顯著增加混合體系中的細(xì)胞數(shù)量，即使在不適合生長的低溫情況下，也可以達(dá)到單種培養(yǎng)組的14.57倍。從生長速率看，高起始密度組 (1∶10) 生長速率顯著低于單種培養(yǎng)組，可能由于營養(yǎng)鹽限制，小球藻在生長后期密度較大，雖定期添加新鮮培養(yǎng)基，仍不能滿足其迅速增殖的需求，導(dǎo)致細(xì)胞生長速率降低。1∶1和1∶0.1組生長速率略高于單種培養(yǎng)組，但差異不顯著，說明對其生長速率影響較大的是起始密度，小皮舟形藻的共存對其也有影響，但影響小于起始密度。隨著混合培養(yǎng)中小皮舟形藻比例降低，β呈逐漸降低趨勢，均值從10.18降至?7.26。即初始細(xì)胞密度比決定了二者之間的競爭結(jié)果，表現(xiàn)為明顯的密度依賴性競爭。

3.3 2種微藻種間競爭結(jié)局及應(yīng)用展望

根據(jù)Lotka-Volterra 競爭模型的解釋，當(dāng)1/K1>α21/K2且1/K2>α12/K1時，物種1和物種2的種內(nèi)競爭強(qiáng)度均大于種間競爭強(qiáng)度，此時兩物種穩(wěn)定共存[29]。本研究中所有處理組均為1/Kc>α/Kp，1/Kp>β/Kc，說明小皮舟形藻和小球藻能夠穩(wěn)定共存。實(shí)際生產(chǎn)中，以硅藻為主的藻相和以綠藻為主的藻相被認(rèn)為對水產(chǎn)養(yǎng)殖有益，前人試圖通過各種方法提高其在藻類群落結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢地位。小皮舟形藻和小球藻分別為硅藻和綠藻的代表物種，本研究表明，2種藻在適宜的溫度條件下可以共存，小球藻對小皮舟形藻的競爭抑制較小，影響小皮舟形藻生長的主要因子是環(huán)境溫度。王朝暉等[30]的研究表明雖然初始密度影響甲藻海洋卡盾藻 (Chattonella marina)、錐狀斯氏藻 (Scrippsiella trochoidea) 和硅藻中肋骨條藻 (Skeletonema costatum) 細(xì)胞種群的初始增長，但在一定環(huán)境條件下 (營養(yǎng)、溫度、光照和培養(yǎng)容量) 每個物種都有自己的環(huán)境容量。本研究中小皮舟形藻在不同溫度下最大細(xì)胞密度為1.03×106個?mL?1，遠(yuǎn)低于小球藻。鄭維發(fā)等[31]研究發(fā)現(xiàn)舟形藻最大細(xì)胞密度達(dá) 0.23×106個?mL?1。筆者之前的研究顯示，優(yōu)化培養(yǎng)基中舟形藻最大密度達(dá) 3.74×106個?mL?1，CSI培養(yǎng)基中則僅為1.46×106個?mL?1，可見舟形藻存在最大環(huán)境容量，且最大細(xì)胞密度數(shù)量級約為 105～106個?mL?1。另外，雖然小皮舟形藻的共存對小球藻有一定影響，但提高起始濃度會顯著增加其細(xì)胞密度，在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過添加小球藻增大其在養(yǎng)殖水體藻相中的競爭優(yōu)勢。