廖慶釗，陳福艷，覃 雅，黃嬋嬋，黃羅冬，申佩弘

（1. 廣西大學(xué)，廣西 南寧 530005； 2. 廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021）

羅非魚(yú)屬于雜食性魚(yú)類，具有易養(yǎng)殖、生長(zhǎng)快的特點(diǎn)，是世界上第二大經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖型魚(yú)類[1-2]。在羅非魚(yú)集約化養(yǎng)殖中病害是目前制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要因素。中國(guó)南方羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)常爆發(fā)由鏈球菌引發(fā)的魚(yú)病。羅非魚(yú)對(duì)無(wú)乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae) 極為敏感，感染后死亡率高，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[3]。一直以來(lái)，養(yǎng)殖戶主要通過(guò)抗生素和其他化學(xué)藥物進(jìn)行魚(yú)病防控。濫用抗生素會(huì)引發(fā)耐藥致病菌增多、抗性基因傳播和生態(tài)失衡等問(wèn)題[4-5]。為解決羅非魚(yú)細(xì)菌病害問(wèn)題，緩解對(duì)抗生素的依賴，亟需尋找防控病害的新資源。

利用環(huán)境友好型微生物作為飼料添加劑來(lái)提高魚(yú)類抗病能力，是當(dāng)下生態(tài)可持續(xù)養(yǎng)殖的新探索[6]。研究表明，發(fā)酵食品中的微生物 (酵母類和乳酸桿菌類) 對(duì)魚(yú)類有顯著的益生作用[5,7-9]。關(guān)于乙醇假絲酵母 (Candida ethanolica) 的研究報(bào)道主要集中于食品發(fā)酵方面，如可可豆發(fā)酵中乙醇假絲酵母通過(guò)產(chǎn)生一些有機(jī)酸以及蛋白質(zhì)而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗真菌能力[10]；在釀造山西老陳醋的過(guò)程中添加乙醇假絲酵母可以起到提香作用[11]；在制作芒果汁工藝中利用乙醇假絲酵母混合菌液可以改善其風(fēng)味[12]。在動(dòng)物飼養(yǎng)方面，F(xiàn)ernandes等[13]對(duì)牛瘤胃的酵母群落結(jié)構(gòu)分析指出乙醇假絲酵母對(duì)牛具有益生潛能；Inoue等[14]用乙醇假絲酵母發(fā)酵魚(yú)粉飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠的免疫力得到顯著增強(qiáng)。因此，乙醇假絲酵母是一種有益生潛能的微生物，具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

乙醇假絲酵母應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖尚未見(jiàn)報(bào)道，本文利用實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存的一株乙醇假絲酵母(Candida ethanolica 菌株 GXU01) 作為飼料添加菌對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，并以羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能、消化能力、腸道菌群結(jié)構(gòu)和免疫抗病能力等指標(biāo)評(píng)價(jià)乙醇假絲酵母的益生作用，以期為羅非魚(yú)健康養(yǎng)殖尋找更有效的飼用添加菌。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及菌株

尼羅羅非魚(yú) (Oreochroms niloticus) 樣本取自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院。菌株乙醇假絲酵母保存于廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室。將菌株GXU01在PDA培養(yǎng)基上活化后，接種于糖蜜液體培養(yǎng)基 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)：糖蜜6%，尿素0.1%，硫酸銨0.1%，滅菌降溫后加無(wú)水乙醇2%)中，37 ℃ 振蕩 (200 r·min?1) 培養(yǎng) 48 h，6 000 r·min?1離心收集菌體。使用磷酸鹽緩沖液 (PBS) 對(duì)菌體沖洗 3遍，將懸浮菌液稀釋成 108CFU·mL?1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用體質(zhì)量為 (100±15) g的健康羅非魚(yú)180尾，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組 (CK) 為基礎(chǔ)飼料中添加 PBS[15-17]，實(shí)驗(yàn)組 (T5) 為基礎(chǔ)飼料中添加GXU01菌體懸浮液，分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 30尾，在魚(yú)塘中設(shè)置長(zhǎng) 2 m×寬 1 m×深 1 m 的網(wǎng)箱飼養(yǎng)。每2周換水1次，確保池塘中的水質(zhì)達(dá)到魚(yú)類生長(zhǎng)要求，養(yǎng)殖期間平均水溫25～32 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼料制備與飼喂

實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料購(gòu)自廣西安桂水產(chǎn)飼料有限公司，飼料大小 2 mm，主要成分 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 為 粗蛋白28%、粗灰分13%、水12%、粗纖維10%、粗脂肪3%、鈣2%、總磷1.5%、賴氨酸1.3%、氯化鈉1%。在飼喂實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，禁食24 h并稱質(zhì)量，按魚(yú)體質(zhì)量2%投喂飼料，每天上、下午分別喂食1次。飼喂前30 min在9 g基礎(chǔ)日糧中加入1 mL濃度為 108CFU·mL?1的懸浮菌液，充分混勻并晾干后投喂[16]。每2周稱質(zhì)量1次，以調(diào)整飼料投喂量，每次投喂30 min后收集剩余飼料，以確定飼料攝入量。分別在喂養(yǎng)30和60 d后，對(duì)各組魚(yú)的生長(zhǎng)性能、血清非特異性免疫參數(shù)和腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 生長(zhǎng)性能測(cè)定與樣品采集

參照Tan等[17]的研究用增質(zhì)量 (WG)、飼料系數(shù) (FCR)、飼料效率 (FE) 和成活率評(píng)價(jià)生長(zhǎng)性能。飼養(yǎng)30和60 d后，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚(yú)。麻醉后采集血樣，將血清于?20 ℃保存，用于測(cè)定血清非特異性免疫力。用500 mg·L?1麻醉劑 (MS-222) 對(duì)魚(yú)實(shí)施安樂(lè)死，冰面解剖，每尾魚(yú)取肝臟1 g，用于測(cè)定抗氧化能力。取全腸道樣品，稱取500 mg添加9.5 mL預(yù)冷PBS緩沖液進(jìn)行勻漿處理，4 ℃、12 000 r·min?1離心 15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10 mL樣品管中用于蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶活性測(cè)定；剩余的腸道樣品用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。用Bradford法測(cè)定總蛋白[18]。肝臟和消化道樣品均用液氮速凍，?80 ℃ 保存。

1.5 消化酶活性的測(cè)定

蛋白酶測(cè)定參照Tan等[17]的方法，木聚糖酶活性測(cè)定參照Saputra等[15]的方法，纖維素酶活性測(cè)定參照Ullah等[16]的方法，以上均用超微量微孔板分光光度計(jì) (BioTek Instruments, Inc.) 測(cè)定。淀粉酶活性采用淀粉酶 (AMS) 測(cè)試盒 (購(gòu)自南京建成生物工程研究所) 測(cè)定。

1.6 血清非特異性免疫參數(shù)測(cè)定

血清超氧化物歧化酶 (SOD) 和溶菌酶 (LZM)活性用試劑盒 (南京建成) 測(cè)定。補(bǔ)體C3和C4用相應(yīng)的魚(yú)補(bǔ)體蛋白 (C3和C4) ELISA試劑盒測(cè)定，其原理應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定補(bǔ)體蛋白水平，在含純化的補(bǔ)體蛋白 (C3或C4) 抗體微孔板中，加入補(bǔ)體蛋白，再與HRP標(biāo)記的補(bǔ)體蛋白 (C3或C4) 抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底清洗后用TMB顯色，通過(guò)顯色的深淺測(cè)定補(bǔ)體蛋白的水平。

1.7 肝臟抗氧化能力的測(cè)定

肝臟總抗氧化能力 (T-AOC) 和丙二醛 (MDA)測(cè)定嚴(yán)格按照相應(yīng)的試劑盒 (南京建成) 說(shuō)明進(jìn)行。

1.8 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定分析

在實(shí)驗(yàn)第4和第8周采集消化道樣本分析微生物多樣性。用 FastDNA Spin kit for Soil (MP Biomedicals) 試劑盒提取消化道樣本中的DNA，所有實(shí)驗(yàn)流程都嚴(yán)格按照制造商的說(shuō)明操作。利用以下引物從獲得的DNA中擴(kuò)增出16S rDNA基因的可變V3—V4區(qū)：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。隨后使用高通量測(cè)序 (HTS) 技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行過(guò)濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列 (Tags)；將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，劃分操作分類單元 (Operational taxonomic units, OTU)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類，基于OTU分析結(jié)果，對(duì)樣品進(jìn)行分類學(xué)分析，研究樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.9 攻毒試驗(yàn)

無(wú)乳鏈球菌用TSB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h，3 000 r·min?1、4 ℃ 離心 10 min 收集菌體細(xì)胞，并用PBS沖洗3次。在攻毒試驗(yàn)之前，用PBS將收集的無(wú)乳鏈球菌稀釋成濃度梯度 (105、106、107、108和 109CFU·mL?1)，每個(gè)濃度取0.1 mL 對(duì) 10尾200 g左右的羅非魚(yú)進(jìn)行肌肉注射，確定7 d 50% 致死量 (LD50) 為 108CFU·mL?1。飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選10尾魚(yú)置于1 m3的水桶中養(yǎng)殖，并注射 0.1 mL濃度為 108CFU·mL?1的無(wú)乳鏈球菌，以注射PBS緩沖液的CK組作為陰性對(duì)照組。每24 h記錄死亡情況，統(tǒng)計(jì)7 d死亡率。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。計(jì)算結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼喂GXU01對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能和消化酶活性的影響

飼喂GXU01后，羅非魚(yú)的生長(zhǎng)特性 (表1) 和消化性能 (圖1) 測(cè)定結(jié)果顯示，與CK組比，T5組的飼料轉(zhuǎn)化率及消化酶 (蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶) 活性均顯著提高，說(shuō)明酵母飼料可以改善羅非魚(yú)的生長(zhǎng)和消化。

圖1 GXU01對(duì)羅非魚(yú)腸道蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶活性的影響CK和T5分別為對(duì)照組和GXU01實(shí)驗(yàn)組；Day 30、Day 60分別表示飼養(yǎng)30和60 d取樣；柱上不同字母表示差異性顯著 (P<0.05)；圖2同此。Figure 1 Effects of GXU01 on activity of gut proteinase, amylase, xylanase and cellulase in tilapiasCK and T5 indicate control and GXU01 treated group, respectively; samples were marked as Day 30 on 30th day and Day 60 on 60th day of feeding; different letters on the bar indicate significant difference (P<0.05). The same case in Figure 2.

表1 GXU01飼料對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 1 Effects of GXU01 feed on growth performance of tilapia

2.2 飼喂GXU01對(duì)羅非魚(yú)血清非特異性免疫力的影響

血清溶菌酶和補(bǔ)體蛋白是常用于評(píng)價(jià)魚(yú)類非特異性免疫的指標(biāo)。與CK組相比，T5組2個(gè)月后羅非魚(yú)血清LZM活性和C3含量顯著提高 (圖2)，說(shuō)明GXU01具有顯著增強(qiáng)羅非魚(yú)非特異性免疫力的作用。

圖2 GXU01對(duì)羅非魚(yú)血清超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4質(zhì)量濃度的影響Figure 2 Effects of GXU01 on serum SOD activity, lysozyme activity, mass concentrations of Complement 3 and Complement 4 in tilapia

2.3 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)

相應(yīng)的菌落結(jié)構(gòu)在門(mén)和屬水平的豐度百分比見(jiàn)圖3。與CK組相比，T5組中梭桿菌門(mén)大幅增加，而藍(lán)細(xì)菌門(mén)大幅減少。在屬水平上，T5組中鯨桿菌屬 (Cetobacterium) 大幅增加，其次是Phreatobacter和艾克曼菌屬 (Akkermansia)；出現(xiàn)大幅減少的是Trachydiscus minutus、Uncultured_bacterium和Tetradesmus obliquus。表示飼喂GXU01對(duì)羅非魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較顯著。

圖3 基于16S rDNA基因序列的羅非魚(yú)腸道在門(mén)水平和屬水平菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度圖CK和T5分別代表對(duì)照組和GXU01的實(shí)驗(yàn)組；投喂30 d取樣標(biāo)為CK-1、T5-1，投喂60 d取樣標(biāo)為CK-2、T5-2；表2、圖4同此。Figure 3 Structure and relative abundance of intestinal flora at phylum and genus of tilapia based on 16s rDNA sequenceCK and T5 indicate control and GXU01 treated group, respectively; samples were marked as CK-1,T5-1 at 30th day and CK-2, T5-2 at 60th day of feeding. The same case in Table 2 and Figure 4.

2.4 腸道菌群多樣性分析

各樣品高通量測(cè)序獲得的OTUs數(shù)量介于557～628，對(duì)這些序列以O(shè)TUs≥97%劃分進(jìn)行聚類，并對(duì)各組樣品進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)評(píng)估，選用指標(biāo)分別為Chao1、Simpson和Shannon(表2)。相對(duì)于CK組，T5組中的Simpson指數(shù)變大，Shannon指數(shù)偏小，表明T5組的菌落多樣性降低。

表2 Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of Alpha diversity index

腸道菌群相似程度用物種豐度聚類熱圖 (圖4)展示，相對(duì)于CK組，T5組出現(xiàn)了較大的差異。在PCoA分析圖 (圖5) 中可以看出，T5組前后兩次取樣 (T5-1和T5-2) 腸道菌群最相近，說(shuō)明飼喂GXU01更有利于維持羅非魚(yú)腸道菌群穩(wěn)定。

圖4 基于屬水平上的物種豐度聚類熱圖Figure 4 Clustering heat map based on species abundance at genus level

圖5 基于binary_chisq距離算法的屬水平PCoA分析圖Figure 5 Genus level PCoA analysis diagram based on binary_chisq distance algorithm

2.5 飼喂酵母飼料對(duì)羅非魚(yú)抗病能力的影響

細(xì)菌半致死攻毒試驗(yàn)是評(píng)價(jià)抗病力最直觀的指標(biāo)[19]。8周喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)統(tǒng)計(jì)羅非魚(yú)在無(wú)乳鏈球菌攻毒后7 d累計(jì)存活情況，評(píng)價(jià)了飼喂微生物后羅非魚(yú)的抗病效果。陰性對(duì)照組在注射PBS緩沖液后7 d內(nèi)無(wú)死亡發(fā)生，而注射無(wú)乳鏈球菌的對(duì)照組累計(jì)成活率在感染后的前5 d明顯下降，然后維持在 (40±10)%。GXU01組成活率為 (66.66±5.77)%，顯著高于對(duì)照組 (圖6)。說(shuō)明GXU01可以顯著增強(qiáng)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌的能力。

圖6 用無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后7 d成活率Figure 6 Survival rate of 7 d after challenge test with S. agalactiae

3 討論

益生菌酵母可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖物種有效的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，這已被多個(gè)研究證實(shí)[20-21]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 和富硒酵母均對(duì)羅非魚(yú)的飼料利用率和生長(zhǎng)性能有顯著的促進(jìn)作用[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中，酵母飼料同樣表現(xiàn)出促生長(zhǎng)性能。酵母的促生長(zhǎng)作用可能部分歸因于酵母本身，因其富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以作為動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑[24]。如補(bǔ)充全細(xì)胞酵母、n-3 HUFA 富集酵母以及β-巰基乙醇處理的酵母能改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，促進(jìn)虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 的生長(zhǎng)[25]；酵母細(xì)胞壁也可以顯著促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng)[26-27 ]。另一種解釋是可能由于消化酶活性增加，腸道的消化能力與生長(zhǎng)性能呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中添加酵母使羅非魚(yú)消化酶活性增加；飼料中添加酵母益生菌可增強(qiáng)舌齒鱸 (Dicentrarchus labrax) 的消化酶活性[28-29]，從而提高其生長(zhǎng)性能；Ullah等[16]的研究也證實(shí)飼喂酵母可提高羅非魚(yú)腸道蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性，進(jìn)而改善其生長(zhǎng)性能。

羅非魚(yú)血清參數(shù)與攻毒試驗(yàn)結(jié)果均顯示，飼喂GXU01能顯著增強(qiáng)羅非魚(yú)的免疫抗病能力。在相似的研究中，Brattgjerd等[30]用來(lái)源于酵母細(xì)胞壁的葡萄糖注射大西洋鮭 (Salmo salar)，發(fā)現(xiàn)大西洋鮭血清LZM活力顯著提升。Yuan等[31]用3%酵母水解物替代魚(yú)粉飼喂建鯉 (Cyprinus carpio var.Jian)，使其血清溶菌酶活性、補(bǔ)體C3和C4水平顯著增加，免疫抗病能力也隨之增強(qiáng)。然而，酵母類物質(zhì)對(duì)促進(jìn)機(jī)體免疫的機(jī)理還有待進(jìn)一步探究。

腸道微生物能夠通過(guò)腸-腦神經(jīng)影響生物體的消化吸收、生長(zhǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)等機(jī)能[32]。飲食可以在很大程度上影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。研究指出對(duì)羅非魚(yú)飼喂添加菌可有效調(diào)節(jié)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，改善其生長(zhǎng)、消化和免疫調(diào)節(jié)能力[33-35]。關(guān)于羅非魚(yú)腸道微生物的報(bào)道中，有研究表明梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)是羅非魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群[36]。Tan等[17]發(fā)現(xiàn)梭桿菌門(mén)是羅非魚(yú)腸道微生物的主要組成。本實(shí)驗(yàn)中攝食GXU01的羅非魚(yú)腸道菌群中梭桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群，而藍(lán)藻門(mén)的豐度大幅降低，可能原因是GXU01會(huì)抑制藍(lán)藻類微生物的生長(zhǎng)。投喂GXU01的羅非魚(yú)中艾克曼菌屬比例顯著高于其他組，表明GXU01能促進(jìn)梭桿菌門(mén)和艾克曼菌屬的生長(zhǎng)。Zhang等[37]研究發(fā)現(xiàn)艾克曼菌屬是一種有益生潛能的腸道微生物，其增強(qiáng)宿主代謝和免疫力的效果顯著。然而，羅非魚(yú)及其腸道微生物作為一個(gè)互利共生的整體，酵母飼料是如何影響其整體機(jī)制的還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，投喂GXU01的羅非魚(yú)血清溶菌酶活性和補(bǔ)體C3含量顯著增加 (P<0.05)，腸道菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為藍(lán)藻門(mén)大幅減少，梭桿菌門(mén)顯著增多；在屬水平上，鯨桿菌屬和艾克曼菌屬兩個(gè)有益菌群的豐度顯著上調(diào) (P<0.05)。結(jié)果表明，GXU01能顯著增強(qiáng)羅非魚(yú)腸道消化酶活性，改善羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能，提高其抗病能力，酵母飼料在羅非魚(yú)養(yǎng)殖中具有較好的益生功效。