郝 賀，鐘翠紅，李欣澤，王海英，武亞南，王風(fēng)申，劉冠慧，石玉祥，張永英

（1. 河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2. 河北中貝佳美生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

家禽是熱應(yīng)激敏感動物，近年來，極端高溫天氣引起的肉雞熱應(yīng)激成為威脅集約化肉雞養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。肉雞發(fā)生熱應(yīng)激后，采食量下降，免疫力降低，致使機體平衡狀態(tài)被打破，進而影響肉雞的生長性能和雞肉品質(zhì)，嚴(yán)重時導(dǎo)致大批死亡，給肉雞養(yǎng)殖造成了重大經(jīng)濟損失[1]。

中藥具有抗熱應(yīng)激、改善腸道菌群等作用，已被廣泛應(yīng)用到肉雞養(yǎng)殖業(yè)[2]。益生菌不僅具有改善肉雞機體功能的作用，還能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生新的活性成分和代謝物，起到抗熱應(yīng)激作用[3]。家禽消化道短，尤其是發(fā)生熱應(yīng)激時，其消化功能降低。中藥因粗纖維含量高而不易被消化吸收，中藥粉散劑因適口性差而影響采食量，中藥提取工藝或技術(shù)欠缺也可導(dǎo)致有效成分不能充分提取出來。中藥發(fā)酵后，其有效成分未被破壞，還能提高有效成分含量并降低有害成分含量，也克服了上述中藥利用的不利因素。當(dāng)前針對家禽熱應(yīng)激以加強飼養(yǎng)管理為主，減少熱應(yīng)激的發(fā)生。河北省禽病中心前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以提高熱應(yīng)激肉雞的生長性能、免疫與抗氧化功能[4?5]。肉雞腸道是熱應(yīng)激損傷的敏感部位之一，腸道微生物對維持正常腸道功能發(fā)揮著重要作用。研究表明，熱應(yīng)激會破壞肉雞腸上皮的結(jié)構(gòu)和功能、微生物的穩(wěn)態(tài)和屏障保護作用[6]。改善熱應(yīng)激條件下家禽的腸道功能可為緩解其熱應(yīng)激提供一種途徑[7]。鑒于此，通過給熱應(yīng)激肉雞飼喂不同劑量的發(fā)酵中藥，分析其對熱應(yīng)激肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為肉雞熱應(yīng)激的中藥防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

1 日齡羅斯308 肉雞，公母各半，購于河北飛龍家禽育種有限公司，飼養(yǎng)于河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院動物房。

1.2 試驗材料

中藥（TCM）添加劑：主要由板藍(lán)根、黃芪、淫羊藿等中藥按一定比例組成，由河北中貝佳美生物科技有限公司加工制成超微粉。

復(fù)合益生菌發(fā)酵菌液：將菌液濃度為5×107cfu/mL 的乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌按照1∶1∶1混合。

發(fā)酵中藥：將復(fù)方中藥超微粉和發(fā)酵菌液按照100（g）∶100（mL）的比例混合，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h ，待用。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

將肉雞飼養(yǎng)至28日齡時，挑選體質(zhì)量相近的健康肉雞180只，隨機分成6組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10 只，公母各半。試驗期間，對照組肉雞飼養(yǎng)在恒溫動物房內(nèi)，飼喂基礎(chǔ)日糧。熱應(yīng)激各組肉雞飼養(yǎng)于試驗雞舍，熱應(yīng)激對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組肉雞日糧中分別加入0.5、1.0、1.5 g/kg 發(fā)酵中藥和1.5 g/kg 未發(fā)酵中藥。試驗期為2019 年7 月14—28日。試驗分組及處理見表1。

表1 試驗肉雞的分組及處理Tab.1 Grouping and treatment of experimental broilers

續(xù)表1 試驗肉雞的分組及處理Tab.1（Continued） Grouping and treatment of experimental broilers

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定 試驗開始時，記錄各組肉雞初始質(zhì)量，試驗開始后，及時記錄每天給料量、損失料量和剩余料量。試驗結(jié)束后，計算平均日采食量（ADFI）、平均日增質(zhì)量（ADG）和料肉比（F/G）。

平均日采食量=（初始料質(zhì)量-余料質(zhì)量）/試驗天數(shù)；

平均日增質(zhì)量=（肉雞末質(zhì)量-肉雞初始質(zhì)量）/試驗天數(shù)；

料肉比=平均日采食量/平均日增質(zhì)量。

1.4.2 樣品采集及處理 試驗結(jié)束后，從每個重復(fù)隨機選取4 只肉雞（公母各半），剖檢后取其1 根盲腸，放入錫箔紙袋，經(jīng)液氮處理后，-80 ℃保存，送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，利用基于16S rDNA擴增子的高通量檢測技術(shù)，以V3-V4區(qū)為引物，檢測熱應(yīng)激肉雞腸道菌群變化。同時參照平板計數(shù)法，另取盲腸內(nèi)容物，進行梯度稀釋，利用麥康凱固體培養(yǎng)基、MRS 固體培養(yǎng)基（含3%碳酸鈣）、SS培養(yǎng)基檢測分析盲腸大腸桿菌、乳酸桿菌和沙門氏菌數(shù)量變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0的One-way ANOVA 進行單因素方差分析，顯著差異者用LSD方法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞生產(chǎn)性能的影響

發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞生產(chǎn)性能的影響見表2。由表2 可知，與空白對照組相比，熱應(yīng)激對照組平均日增質(zhì)量、平均日采食量分別顯著降低29.86%和23.83%，料肉比顯著升高7.59%。與熱應(yīng)激對照組相比，1.0 g/kg 和1.5 g/kg 發(fā)酵中藥組肉雞平均日增質(zhì)量和平均日采食量均顯著增加，料肉比均顯著降低。其中，1.5 g/kg 發(fā)酵中藥組效果較好，平均日增質(zhì)量和平均日采食量分別顯著增加36.30%和26.42%，料肉比顯著降低8.82%。這表明熱應(yīng)激明顯降低了肉雞的生長性能，但中藥能在一定程度上提高熱應(yīng)激狀態(tài)下肉雞生產(chǎn)性能，作用效果隨發(fā)酵中藥添加量的增加而增強，且發(fā)酵后中藥效果優(yōu)于未發(fā)酵中藥。

表2 發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞生長性能的影響Tab.2 Effect of fermented Chinese medicine on growth performance of broilers under heat stress

2.2 發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞腸道微生物的影響

2.2.1 盲腸微生物多樣性分析 稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理可用，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種。由圖1可知，與空白對照組相比，與熱應(yīng)激組肉雞盲腸微生物多樣性明顯降低。飼喂中藥后，熱應(yīng)激對照組相比，0.5、1.0、1.5 g/kg發(fā)酵中藥組和1.5 g/kg中藥組肉雞盲腸微生物多樣性明顯升高，且0.5、1.0、1.5 g/kg 發(fā)酵中藥組高于1.5 g/kg 中藥組，其中，按1.0、1.5 g/kg 的劑量飼喂發(fā)酵中藥時，肉雞盲腸微生物多樣性豐富。這表明熱應(yīng)激能降低肉雞盲腸微生物多樣性，中藥可抑制熱應(yīng)激對腸道菌群的作用，發(fā)酵中藥的效果優(yōu)于未發(fā)酵中藥。

2.2.2 盲腸微生物群組成結(jié)構(gòu)分析 由圖2 可知，空白對照組肉雞盲腸菌群以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）為主。5個熱應(yīng)激處理組的肉雞盲腸細(xì)菌多樣性發(fā)生了不同程度變化，其中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、軟壁菌門（Tenericutes）4 個門的相對豐度變化明顯。與空白對照組相比，5 個熱應(yīng)激處理組肉雞盲腸的厚壁菌門、軟壁菌門相對豐度均明顯升高。飼喂中藥后，與熱應(yīng)激對照組相比，肉雞盲腸的厚壁菌門相對豐度升高幅度小，隨發(fā)酵中藥飼喂劑量的增加而增加，軟壁菌門相對豐度升高幅度稍大；擬桿菌門、放線菌門相對豐度均明顯降低。飼喂發(fā)酵中藥肉雞盲腸的擬桿菌門相對豐度降低幅度大，發(fā)酵中藥飼喂劑量越大，下降越明顯，放線菌門相對豐度降低幅度無明顯變化。其中，按1.5 g/kg 的劑量添加發(fā)酵中藥或未發(fā)酵中藥時，厚壁菌門、軟壁菌門相對豐度升高，擬桿菌門相對豐度降低。

由圖3 可見，與空白對照組相比，5 個熱應(yīng)激處理組的肉雞盲腸細(xì)菌菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度變化，盲腸內(nèi)容物均包含優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Blautia屬等微生物。與空白對照組相比，5 個熱應(yīng)激處理組肉雞盲腸的乳桿菌屬細(xì)菌豐度均明顯升高；擬桿菌屬、Blautia屬細(xì)菌豐度明顯減少。飼喂中藥后，與熱應(yīng)激對照組相比，肉雞盲腸的乳桿菌屬細(xì)菌豐度減少，Blautia屬細(xì)菌豐度明顯增加。其中，飼喂發(fā)酵中藥的肉雞盲腸Blautia屬細(xì)菌豐度較未發(fā)酵中藥增加幅度小，且Blautia屬豐度隨發(fā)酵中藥飼喂量的增加而增加。表明飼喂不同劑量的發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞腸道菌群的調(diào)控作用不同。

2.3 發(fā)酵中藥對熱應(yīng)激肉雞盲腸菌群的影響

發(fā)酵中藥對肉雞盲腸菌群的影響見表3。由表3可知，與空白對照組相比，熱應(yīng)激對照組乳酸桿菌含量顯著降低11.84%，沙門氏菌、大腸桿菌含量分別顯著增加1.64%和3.69%，0.5、1.0、1.5 g/kg發(fā)酵中藥組肉雞盲腸中乳酸桿菌含量顯著增加，沙門氏菌和大腸桿菌含量顯著降低，但1.5 g/kg 中藥組肉雞盲腸中乳酸桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌含量無明顯變化。與熱應(yīng)激對照組相比，0.5、1.0、1.5 g/kg 發(fā)酵中藥組和1.5 g/kg 中藥組肉雞盲腸中乳酸桿菌含量顯著增加，分別增加24.13%、24.43%、25.04%和18.40%，大腸桿菌含量分別顯著降低6.13%、6.55%、11.25%和2.99%，沙門氏菌含量分別顯著降低3.23%、13.33%、13.74%和1.21%。與1.5 g/kg 中藥組相比，0.5、1.0、1.5 g/kg 發(fā)酵中藥組肉雞盲腸中乳酸桿菌含量稍有增加，但差異不顯著，大腸桿菌含量分別顯著降低3.23%、3.67%和8.52%，沙門氏菌含量顯著降低2.04%、12.27%和12.68%。這表明熱應(yīng)激能夠降低肉雞盲腸中乳酸桿菌含量，增加沙門氏菌和大腸桿菌含量，中藥能夠顯著改變這一狀況，中藥發(fā)酵以后效果更好，且作用效果隨日糧中添加發(fā)酵中藥劑量增加而增強。

表3 發(fā)酵中藥對肉雞盲腸乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌含量的影響Tab.3 Effect of fermented traditional Chinese medicine on cecal flora of broilers ×106 cfu/g

3 結(jié)論與討論

高溫、低溫均會使動物產(chǎn)生應(yīng)激現(xiàn)象，由于肉雞特殊的解剖結(jié)構(gòu)和生理特點，熱應(yīng)激對肉雞影響相對嚴(yán)重，持續(xù)熱應(yīng)激的危害更為明顯。在熱應(yīng)激情況下，肉雞為維持體溫平衡，會減少采食來降低溫度，使得生產(chǎn)性能降低。SOHAIL等[8]、GOO等[9]證實，持續(xù)熱應(yīng)激可引起肉雞日增質(zhì)量、飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低，降低養(yǎng)殖效益。本試驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，熱應(yīng)激組肉雞平均日增質(zhì)量和平均日采食量明顯降低，料肉比顯著升高。發(fā)酵中藥對改善熱應(yīng)激肉雞生長性能具有積極的作用。中藥活性成分主要聚集在中藥植物細(xì)胞壁內(nèi)，中藥經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理后，中藥細(xì)胞壁中有效成分和活性分子充分釋放出來，某些不能被動物直接利用的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，提高了有效成分的利用率[10?14]。另外，乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些酶，對促進動物發(fā)育生長、提高飼料利用率等方面也是有益的。史洪濤等[15]證實，黃芪-枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能提高肉雞平均日增質(zhì)量和平均日采食量，降低料肉比。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥不論是否經(jīng)過發(fā)酵處理，均能提高熱應(yīng)激肉雞平均日增質(zhì)量和平均日采食量，降低料肉比。但發(fā)酵中藥并未完全抵消熱應(yīng)激對肉雞帶來的負(fù)面影響，可能由于本研究選取的中藥味苦降低了日糧適口性。飼喂發(fā)酵中藥對改善持續(xù)熱應(yīng)激誘發(fā)肉雞生長抑制的作用效果較好，其中隨發(fā)酵中藥飼喂量的增加，肉雞料肉比降低，可能是因為中藥發(fā)酵后中藥味道降低，使肉雞采食量升高。

熱應(yīng)激是導(dǎo)致家禽低采食量與腸道功能紊亂的關(guān)鍵因素。胃腸道菌群多樣性和動態(tài)性在宿主健康中起著至關(guān)重要的作用[16]。熱應(yīng)激條件下，宿主菌群動態(tài)的微生態(tài)平衡遭到破壞，正常菌群會發(fā)生變化，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，甚至因免疫抵抗力下降而不同程度死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失[17?18]。乳酸桿菌是厚壁菌門乳桿菌屬可使葡萄糖等糖類分解為乳酸的各種細(xì)菌的總稱，但不同的乳酸桿菌菌種存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以提高肉雞的日增質(zhì)量，降低日采食量和料肉比[15]；還有研究表明，乳酸桿菌對肉雞生產(chǎn)性能無顯著影響[19]；此外，有研究認(rèn)為，飼糧中添加乳酸桿菌抑制了肉雞生長[20?21]。本研究中，空白對照組肉雞的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，而熱應(yīng)激降低了肉雞擬桿菌門和放線菌門的豐度，增加了厚壁菌門的豐度。同時，也增加了肉雞盲腸中乳桿菌屬細(xì)菌豐度。飼喂中藥后，肉雞盲腸中厚壁菌門和乳桿菌屬豐度降低，但通過對特定菌群分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌豐度增加。其原因可能是發(fā)酵中藥對厚壁菌門和乳桿菌屬中其他菌種的降低效果強于對乳酸桿菌的增加效果，具體菌種種類還需進一步分析。OLNOOD 等[22]、SHOKRYAZDAN 等[23]、LI 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌能夠增加肉雞回腸和盲腸中乳酸菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量，維持腸道健康。本研究中，試驗組盲腸中大腸桿菌和沙門氏菌顯著降低。邢爽[25]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可提高熱應(yīng)激肉雞盲腸液抗沙門氏菌的能力，這可能歸因于乳酸桿菌能產(chǎn)生有機酸、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)來抑制有害菌的生長。本研究中，飼喂發(fā)酵中藥可增加肉雞盲腸中Blautia屬細(xì)菌豐度。Blautia屬細(xì)菌能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這可能是緩解熱應(yīng)激對肉雞腸道菌群影響的因素之一[26]。另外，河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院畜禽疾病與防控課題組研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加發(fā)酵中藥可以降低熱應(yīng)激對肉雞的負(fù)面影響，提高熱應(yīng)激肉雞免疫和抗氧化功能，并提高了肌肉氨基酸含量，表明該發(fā)酵中藥有防治肉雞熱應(yīng)激的應(yīng)用價值[27]。

綜上，在熱應(yīng)激肉雞日糧中添加發(fā)酵中藥能夠明顯改善熱應(yīng)激肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)、增加有益菌并降低有害菌數(shù)量，提高肉雞生產(chǎn)性能，其中按1.5 g/kg劑量飼喂發(fā)酵中藥的效果最佳。發(fā)酵中藥在防控肉雞熱應(yīng)激方面有極大的應(yīng)用前景。