馬嘉俊，吳英華，李 璿，李梅蘭，侯雷平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/山西省設(shè)施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷 030800）

硫代葡萄糖苷又稱硫苷，主要存在于白菜、甘藍(lán)、蘿卜、擬南芥等十字花科植物中[1?2]。硫苷不僅是植物主要的防御化合物[3]，對人體健康也有重要作用[4]。氮是構(gòu)成硫苷的重要成分，也是植物生長發(fā)育所必需的元素[5]。植物吸收氮素以硝態(tài)氮為主，且吸收、轉(zhuǎn)運過程均依賴硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白[6]。這類轉(zhuǎn)運蛋白主要包括硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1（Nitrate transporter 1，NRT1）、硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白2[7]（Nitrate transporter 2，NRT2）、氯酸鹽通道蛋白（Chloride channei，CLC）以及慢離子相關(guān)通道同系物（Slow anion channel?as?sociated homologs，SLAC/SLAH）[8]。

PTR 基因家族與NTR1 基因家族具有高度同源性，將其歸屬為同一基因家族，因此，NTR1/PTR 基因家族又被稱為NPF 基因家族[9]，即質(zhì)子依賴性寡肽轉(zhuǎn)運蛋白家族[10]，是植物中最大的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族[11]。NPF 基因家族主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運氨基酸、寡肽和NO3-[12]，還可以轉(zhuǎn)運鉀鹽、硫苷以及植物激素等[13]。NPF 基因家族幾乎存在于所有植物，尤其是高等植物中[14]。在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出53 個NPF家族成員[15]。已有研究確定了該家族中的8 個亞族，將其命名為NPF1—NPF8[16]。其中，NPF1 亞家族成員是一種高親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，參與結(jié)瘤和根系構(gòu)筑；NPF2 亞家族成員是硝酸鹽和硫苷轉(zhuǎn)運蛋白。NPF1 和NPF2 因親緣關(guān)系較近被稱為NPF1/NPF2 亞族。NPF3 是最小的NPF 亞家族；NPF4 亞家族成員可以運輸細(xì)胞分裂素；NPF5 亞家族成員是一種傷口誘導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)運蛋白；NPF6 亞家族成員是雙親和力硝酸鹽流入轉(zhuǎn)運蛋白和硝酸鹽傳感器，運輸生長素，且參與硝酸鹽外流；NPF7 亞家族成員是參與硝酸鹽流入和流出的雙向轉(zhuǎn)運蛋白；NPF8 亞家族成員是一種低親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。

大白菜（Brassica rapasubsp. pekinensis）又稱結(jié)球白菜，屬于十字花科植物，生產(chǎn)成本低、風(fēng)味良好、耐運輸[17]。大白菜還富含多種礦物質(zhì)、維生素以及硫代葡萄糖苷[18]，有較高的食用和藥用價值。目前，對擬南芥NPF 基因家族方面的研究較多，擬南芥中硝酸鹽和硫苷的吸收、轉(zhuǎn)運及分配均靠NPF 基因家族蛋白實現(xiàn)[19]。其他作物中關(guān)于NPF基因家族與硝酸鹽長途轉(zhuǎn)運關(guān)系的研究主要集中在小麥和水稻上，白菜方面還未見有報道[20]。鑒于此，以擬南芥基因組為參考，鑒定并從基因理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以及構(gòu)建進(jìn)化樹等方面分析白菜NPF 基因家族成員，為進(jìn)一步探索白菜NPF 基因家族功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 白菜NPF基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

從Pfam 數(shù)據(jù)庫中獲得NPF 基因家族結(jié)構(gòu)域（PF00854）的HMM profile 文件，利用HMMER 3.0搜索擬南芥、白菜全基因組，獲取其候選基因，進(jìn)而獲取其蛋白質(zhì)序列和基因序列的FASTA 格式。利用NCBI 中的CDD 和SMART 數(shù)據(jù)庫對候選基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢測，刪除含有NPF 結(jié)構(gòu)域但不完整的基因序列或者不含NPF 基因家族結(jié)構(gòu)域的基因序列[21]。

利用在線軟件ExPASy（https://www.expasy.org/）對篩選出的白菜NPF 基因家族蛋白序列進(jìn)行氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和原子總數(shù)等理化性質(zhì)分析[22]。

1.2 白菜NPF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 7.0 軟件對白菜和擬南芥NPF 基因家族蛋白序列進(jìn)行比對，采用NJ（Neighbor-joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹[23]，利用在線軟件iTOL（https://itol.embl.de/）對進(jìn)化樹進(jìn)行簡單修飾。

1.3 白菜NPF基因家族染色體定位分析

利用在線工具M(jìn)G2C(http://mg2c. Iask. in/mg2c_v2.0/)[24]對白菜NPF 基因家族成員進(jìn)行染色體定位。

1.4 白菜NPF基因家族二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

利用在線軟件SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_so Pma.html）對白菜NPF 基因家族蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[25]，利用在線軟件CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對白菜NPF基因家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.5 白菜NPF基因家族結(jié)構(gòu)及保守基序分析

利用在線工具GSDS（http://gsds.gao-lab.org/index.php）對白菜NPF 基因家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，利用在線工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/）[26]和TBtools 軟件對白菜NPF 基因家族蛋白進(jìn)行保守基序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜NPF基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

通過HMMER 3.0 以及BLAST 在白菜基因組中找到99 個NPF 基因家族成員，通過NCBI 中的CDD和SMART 數(shù)據(jù)庫比對刪除含有NPF 結(jié)構(gòu)域但不完整的基因序列或者不含NPF 基因家族結(jié)構(gòu)域的基因序列后，留下72 個明確屬于NPF 基因家族的基因。對白菜NPF 基因家族蛋白理化性質(zhì)分析的結(jié)果（表1）表明，白菜NPF 基因家族蛋白在氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)以及親水性方面均存在差異。白菜NPF 基因家族蛋白序列中氨基酸的數(shù)量為497～1 117 個，75.00%的白菜NPF 基因家族成員的氨基酸數(shù)量介于500～600個。白菜NPF基因家族蛋白序列的分子質(zhì)量為54.49～123.21 ku，與氨基酸數(shù)量變化趨勢一致。白菜NPF 基因家族蛋白序列的等電點在5.72～9.47，72個白菜NPF 基因家族蛋白中有63個蛋白質(zhì)的等電點大于7.5，說明白菜NPF 基因家族蛋白大部分屬于堿性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)小于40 即為穩(wěn)定蛋白，NPF 基因家族蛋白中有10個蛋白質(zhì)序列不穩(wěn)定系數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白，剩余的均為穩(wěn)定蛋白。白菜NPF 基因家族蛋白序列的脂肪系數(shù)在88.79～113.74。其中，脂肪系數(shù)大于100 的有38 個。白菜NPF 基因家族蛋白親水性均為正值，說明均為疏水蛋白。

表1 白菜NPF基因家族蛋白理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of NPF gene family proteins in Chinese cabbage

續(xù)表1 白菜NPF基因家族蛋白理化性質(zhì)Tab.1（Continued） Physical and chemical properties of NPF gene family proteins in Chinese cabbage

2.2 擬南芥與白菜NPF基因家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將鑒定到的72 個白菜NPF 基因家族蛋白序列與擬南芥53 個NPF 基因家族蛋白序列合并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，依據(jù)親緣關(guān)系將白菜NPF 基因家族分為8個亞族（圖1）。其中，NPF1與NPF2亞族進(jìn)化關(guān)系近，親緣性高。就單個亞族來講，NPF5 亞族中包含的NPF 基因家族成員最多，其中，有26 個為白菜NPF 基因家族成員。NPF3 亞族在擬南芥中只有1個基因家族成員，在白菜中篩選到2個基因家族成員。NPF6 亞族與NPF4 亞族在同一個分支上，說明其親緣關(guān)系較近。NPF7 亞族和NPF8 亞族的親緣關(guān)系較近。

2.3 白菜NPF基因家族成員在染色體上的定位分析

染色體定位結(jié)果（圖2）表明，NPF 基因家族成員不均勻地分布在白菜的10條染色體上。其中，定位到A09、A07 染色體上的基因數(shù)目較多，分別有17、12個白菜NPF基因家族成員。A02、A06、A01染色體上分別定位到了10、9、7 個白菜NPF 基因家族成員。A05、A08 染色體上均定位到了4 個白菜NPF基因家族成員。A03、A04、A10 染色體上均定位到了3 個白菜NPF 基因家族成員。A07、A08、A10 染色體上的白菜NPF 基因家族成員均定位在染色體下端，其余染色體上、下端均定位有白菜NPF 基因家族成員。

2.4 白菜NPF基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

白菜NPF 基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（表2）。其中，以α-螺旋為主，其次為無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角占比最小。α-螺旋占比在43.95%～54.43%。其中，α-螺旋在二級結(jié)構(gòu)中占比在50%及以上的白菜NPF 基因家族蛋白有18個。β-轉(zhuǎn)角占比在2.17%～5.33%。

亞細(xì)胞定位結(jié)果（表2）表明，所有的白菜NPF基因家族蛋白均定位于質(zhì)膜上，推測白菜NPF 基因家族蛋白主要在質(zhì)膜上起作用。

表2 白菜NPF基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位Tab.2 Secondary structure and subcellular location prediction of the NPF gene family proteins in Chinese cabbage

續(xù)表2 白菜NPF基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位Tab.2（Continued） Secondary structure and subcellular location prediction of the NPF gene family proteins in Chinese cabbage

續(xù)表2 白菜NPF基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位Tab.2（Continued） Secondary structure and subcellular location prediction of the NPF gene family proteins in Chinese cabbage

2.5 白菜NPF基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

白菜NPF 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)見圖3，灰色方框為白菜NPF 基因家族成員的CDS 序列。由圖3 可以看出，白菜NPF 基因家族成員含有3～13 個CDS 序列。其中，有9 個基因含有3 個CDS 序列，39個基因含有4 個CDS 序列，說明白菜NPF 基因家族成員中含有的CDS 序列主要為4 個，17 個基因含有5 個CDS 序 列，4 個 基 因 含 有6 個CDS 序 列，Bra038280含有7 個CDS 序列，Bra008011含有8 個CDS 序列，Bra016534含有的CDS 序列數(shù)量最多，有13 個。CDS 序列數(shù)量差異較大，說明白菜NPF 基因家族成員具有多樣性。

2.6 白菜NPF基因家族蛋白保守基序分析

白菜NPF 基因家族蛋白保守基序分布見圖4。72 個白菜NPF 基因家族蛋白均含有保守基序1、保守基序2、保守基序8 和保守基序9。其中，有59個基因家族蛋白分別含有10 個保守基序，說明白菜NPF 基因家族蛋白保守性較高。有10 個白菜NPF基因家族蛋白不含保守基序10。Bra035886、Bra017585沒有保守基序7；Bra012052沒有保守基序3、保守基序7 和保守基序10；Bra017582沒有保守基序6；Bra035885沒有保守基序5 和保守基序10。

3 結(jié)論與討論

NPF 基因家族在植物體生長發(fā)育過程中必不可少，其家族成員不僅可以調(diào)控氮元素的吸收、運輸以及再利用過程[9]，還可以調(diào)控硫苷的空間分布以保護(hù)植物免受昆蟲危害。本研究以擬南芥NPF基因家族為參考，在白菜中共鑒定出72個NPF基因家族成員，而擬南芥NPF 基因家族中成員為53 個，蘋果NPF 基因家族成員為73 個[27]。水稻NPF 基因家族成員數(shù)量目前最多，有93 個。上述結(jié)果表明，白菜基因組多樣化高于擬南芥，低于水稻和蘋果。

72 個白菜NPF 基因家族蛋白的氨基酸數(shù)量在497～1 117 個，其中，75.00%的白菜NPF 基因家族蛋白的氨基酸數(shù)量介于500～600個。白菜NPF基因家族蛋白等電點大于7.5的有63個，多在堿性范圍，說明白菜NPF 基因家族蛋白富含堿性氨基酸。白菜NPF 基因家族蛋白大多為穩(wěn)定的疏水蛋白。二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，白菜NPF 基因家族蛋白組成均以α-螺旋為主，α-螺旋占比在50%及以上的NPF基因家族蛋白有18個；其次為無規(guī)則卷曲，含量最少的為β-轉(zhuǎn)角；白菜NPF 基因家族蛋白均定位于質(zhì)膜上。楊林[28]、江定[29]分別對甘藍(lán)型油菜、芥藍(lán)的NPF2.10 和NPF2.11 蛋白進(jìn)行了鑒定及亞細(xì)胞定位，也均定位在質(zhì)膜上，與本研究結(jié)果一致。對白菜NPF 基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族大部分成員含有4個CDS序列?？讉サ萚11]對花生NRT1 基因家族成員進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)大部分含有4個CDS 區(qū)域；而蘋果NPF 基因家族成員大部分也含有4個CDS區(qū)域[27]。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，白菜NPF 基因家族蛋白可按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分為8 個亞族，分別為NPF1、NPF2、NPF3、NPF4、NPF5、NPF6、NPF7、NPF8。每個亞族的成員數(shù)量都各不相同，這與其功能及進(jìn)化的復(fù)制和丟失有關(guān)[30]；同一亞族的蛋白質(zhì)保守基序較為相似，說明具有相同的功能[31]。蘋果NPF 基因家族成員在根、葉、莖、花和果實中表達(dá)，但是在特定的組織中，不同的發(fā)育階段其表達(dá)量也有差異[27]。目前，白菜NPF 基因家族在不同部位及不同發(fā)育階段的表達(dá)情況未知，下一步將深入研究，解析其與硝酸鹽以及硫苷轉(zhuǎn)運之間的關(guān)系，為探明植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白奠定基礎(chǔ)。