石桃雄，鄭俊青，黎瑞源，呂 丹，陳慶富，梁成剛

（1. 貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001；2. 貴州省信息與計算科學(xué)重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550001）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）是雙子葉蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（FagopyrumMill）植物，亦名韃靼蕎麥（Tartary buckwheat），為1 年生草本植物，和甜蕎（Fagopyrum esculentum）并列為蕎麥屬植物的兩大栽培種[1]?？嗍w種子蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、維生素B2和微量元素含量等都高于小麥和水稻，且含有谷類作物沒有的類黃酮和葉綠素[2]。苦蕎種子蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全，且配比合理，不僅具有較高的營養(yǎng)價值，還具有降膽固醇[3?4]、降血壓[5]、降血糖[6]、抗癌、抗腫瘤[7?8]和抗氧化[9?10]等作用，在食品加工和醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

前人研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎種子蛋白質(zhì)含量具有豐富的遺傳變異。GUO 等[11]測定了從貴州、江西、四川等省收集的二倍體苦蕎、四倍體苦蕎和野生苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明，57 份苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)含量平均為12.17%，變幅為7.82%～18.94%，變異系數(shù)為21.89%。鄭俊青等[12]對苦蕎重組自交系群體的種子蛋白質(zhì)含量進(jìn)行變異分析，發(fā)現(xiàn)221 個株系種子蛋白質(zhì)含量均值為7.59%，變幅為4.46%～11.42%，變異系數(shù)為15.30%。除了基因型，苦蕎種子蛋白質(zhì)含量也受施肥[13]和種植環(huán)境[14]的影響。

根據(jù)溶解性不同，種子蛋白質(zhì)可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四大類。不同谷物種子中各蛋白質(zhì)組分占總蛋白質(zhì)含量比例具有很大差異，小麥種子以醇溶蛋白和谷蛋白為主，占比分別為37.0%～42.7%和31.5%～34.1%[15]。水稻種子中谷蛋白占比（78.4%）最高[16]，玉米種子中醇溶蛋白占比（60%）最高[17]，豆類中球蛋白占比（71.49%）最高[18]。各蛋白質(zhì)組分具不同的食品功能特性。種子谷蛋白和醇溶蛋白含量占比高的水稻品種，其米質(zhì)性狀和蒸煮食味品質(zhì)表現(xiàn)更突出[16]。小麥面粉的筋力與種子醇溶蛋白和谷蛋白含量呈極強(qiáng)的正相關(guān)，與種子清蛋白和球蛋白含量呈負(fù)相關(guān)[19]。清蛋白和球蛋白營養(yǎng)價值高，且具有較好的溶解性、乳化性、起泡性和持油性等，可作為食品添加劑，用于提升蛋糕、餅干、冰淇淋等食品的營養(yǎng)和品質(zhì)[20?22]。

目前，有關(guān)苦蕎種子蛋白質(zhì)組分的研究主要集中在提取方法、結(jié)構(gòu)特性和生理活性等方面，苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)組分含量的研究報道不多[11，14]，且供試的種質(zhì)資源數(shù)目較少，不能充分體現(xiàn)苦蕎種子蛋白質(zhì)的基因型差異。為此，以來自貴州、湖南、云南、四川、山西、陜西、甘肅和西藏等?。▍^(qū)）的231 份苦蕎種質(zhì)資源為試驗材料，對種子蛋白質(zhì)及其組分含量進(jìn)行分析，揭示苦蕎蛋白質(zhì)組分含量的遺傳多樣性，為苦蕎優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)品種的選育提供理論依據(jù)和推薦育種材料。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2018 年8 月在貴州師范大學(xué)百宜鎮(zhèn)試驗 基 地（106°63'E、26°64'N）進(jìn) 行。該 地 海 拔1 330 m，土壤基礎(chǔ)肥力為銨態(tài)氮78.84 mg/kg、速效磷56.45 mg/kg、速 效 鉀112.30 mg/kg、有 機(jī) 質(zhì)2.91 g/kg[23]。

供試的231 份苦蕎種質(zhì)資源由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心收集，包括來自貴州、湖南、云南、四川、山西、陜西、甘肅和西藏等?。▍^(qū)）的審定品種、地方種質(zhì)和育種品系，種質(zhì)資源信息具體見表1。

表1 苦蕎種質(zhì)資源名稱及來源Tab.1 Name and origin of Tartary buckwheat germplasm resources

續(xù)表1 苦蕎種質(zhì)資源名稱及來源Tab.1（Continued） Name and origin of Tartary buckwheat germplasm resources

1.2 田間種植

每份苦蕎種質(zhì)資源種植1 個小區(qū)，小區(qū)面積為2 m2，3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，施375 kg/hm2復(fù)合肥（總養(yǎng)分含量≥45%，N-P2O5-K2O 配比為14∶16∶15）和150 kg/hm2過磷酸鈣（含P2O514%），常規(guī)田間管理。籽粒成熟后，每個小區(qū)選取具有代表性的8 個單株混合脫粒，風(fēng)干，稱取20～30 g 飽滿籽粒用高速粉碎機(jī)充分研磨成粉末，備用。

1.3 苦蕎籽粒蛋白質(zhì)組分的提取和測定

各蛋白質(zhì)組分的提取采用順序提取法，略作改進(jìn)。稱取苦蕎籽粒粉末0.500 g 置于10 mL 離心管中，加入6 mL 0.01 mol/L Tris-HCl 溶液（pH 值7.5），渦旋混勻后，4 ℃超聲萃取5 min 提取清蛋白，12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液。在清蛋白沉淀中加入6 mL 0.01 mol/L Tris-HCl（pH 值7.5）和0.5 mol/L NaCl 的混合溶液提取球蛋白，提取步驟同清蛋白。另稱取苦蕎籽粒粉末0.500 g 置于10 mL離心管中，加入6 mL 60%正丙醇溶液提取醇溶蛋白，在沉淀中加入6 mL 5.0 g/L 酒石酸鈉、2.4 g/L CuSO4、16.8 g/L KOH和50%正丙醇的混合溶液提取谷蛋白。取20 μL各蛋白質(zhì)組分的提取液于酶標(biāo)板上，加入200 μL 200 mg/L 考馬斯亮藍(lán)G-250，每個樣品2 個重復(fù)，采用酶標(biāo)儀在595 nm 下測吸光值。牛清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和各蛋白質(zhì)組分的測定參照張啟迪等[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 軟件對蛋白質(zhì)組分含量進(jìn)行相關(guān)性分析、類群間的F檢驗和多重比較（Duncan’s新復(fù)極差法）。采用Excel 2019 的Frequency 函數(shù)計算蛋白質(zhì)及其組分含量的頻數(shù)。采用RStudio 應(yīng)用程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)及其組分含量進(jìn)行聚類分析，分析方法同呂丹等[24]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)及其組分含量的變異分析

由表2 可知，231 份苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)總含量均值為77.78 mg/g，變幅為55.03～104.69 mg/g。4 種蛋白質(zhì)組分中谷蛋白和清蛋白含量均值最高，分別為30.53 mg/g 和30.32 mg/g，變幅分別為14.70～43.68 mg/g 和13.34～54.07 mg/g；球蛋白含量次之，平均值為13.72 mg/g，變幅為9.38～20.35 mg/g；醇溶蛋白含量最低，平均值為3.21 mg/g，變幅為1.14～5.99 mg/g?？偟鞍踪|(zhì)和各蛋白質(zhì)組分含量存在不同程度的變異，變異系數(shù)表現(xiàn)為清蛋白（24.5%）＞醇溶蛋白（24.2%）＞谷蛋白（19.6%）＞球蛋白（16.5%）＞總蛋白質(zhì)（12.7%）?？偟鞍踪|(zhì)和各蛋白質(zhì)組分含量的偏度和峰度的絕對值總體均小于1（表2），呈近似的正態(tài)分布（圖1），說明這些性狀均是由多基因控制的數(shù)量性狀。

表2 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)及其組分含量的變異Tab.2 Variation of contents of protein and its components of seeds of Tartary buckwheat germplasm resources

2.2 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)組分占比的差異

按種子中各蛋白質(zhì)組分占總蛋白質(zhì)含量比例的高低可將231 份供試苦蕎種質(zhì)資源劃分為4 種類型（表3），其中，120份種質(zhì)資源表現(xiàn)為清蛋白＞谷蛋白＞球蛋白＞醇溶蛋白，占比均值分別為43.9%、34.8%、17.4%、3.9%；109 份種質(zhì)資源表現(xiàn)為谷蛋白＞清蛋白＞球蛋白＞醇溶蛋白，占比均值分別為44.2%、33.1%、18.1%、4.5%；1 份表現(xiàn)為清蛋白（39.6%）＞球蛋白（29.1%）＞谷蛋白（26.6%）＞醇溶蛋白（4.7%）；還有1份表現(xiàn)為谷蛋白（48.8%）＞球蛋白（24.2%）＞清蛋白（21.3%）＞醇溶蛋白（5.7%）。由上可見，99.1%（229份）的供試苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)主要由清蛋白和谷蛋白組成，二者共占蛋白質(zhì)總含量的67.9%～88.1%。

表3 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)組分占總蛋白質(zhì)含量的比例Tab.3 Proportion of protein components contents in total protein content of seeds of Tartary buckwheat germplasm resources

2.3 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)及其組分含量的相關(guān)性分析

從表4 可以看出，苦蕎種質(zhì)種子總蛋白質(zhì)含量除與醇溶蛋白含量相關(guān)性不顯著外，與其他3 個蛋白質(zhì)組分含量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)為清蛋白＞谷蛋白＞球蛋白。醇溶蛋白含量與清蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與球蛋白含量呈極顯著正相關(guān)，與谷蛋白含量呈顯著正相關(guān)。其他蛋白質(zhì)組分含量之間的相關(guān)性不顯著。

表4 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)及其組分含量的簡單相關(guān)系數(shù)Tab.4 Pearson correlation coefficient between protein and its components contents of seeds of Tartary buckwheat germplasms

2.4 苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)及其組分含量的聚類分析

基于種子蛋白質(zhì)及其組分含量對供試苦蕎種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析（圖2），在歐式距離為16.0～18.3處，231份種質(zhì)資源被聚為六大類群。由圖2和表5 可知，類群Ⅰ包含41 份苦蕎種質(zhì)資源，種子總蛋白質(zhì)和清蛋白含量平均值最高，分別為87.98 mg/g和37.59 mg/g，均顯著高于其他5 個類群；谷蛋白含量均值為34.51 mg/g，顯著高于除類群Ⅴ和Ⅵ外的其他3 個類群。類群Ⅱ包含53 份苦蕎種質(zhì)資源，種子球蛋白和醇溶蛋白含量均值最低，分別為11.98 mg/g 和2.54 mg/g，球蛋白含量均值顯著低于除類群Ⅲ外的其他4 個類群，醇溶蛋白含量均值顯著低于其他5個類群。類群Ⅲ包含45 份苦蕎種質(zhì)資源，種子總蛋白質(zhì)和清蛋白含量均值最低，分別為68.83 mg/g 和21.96 mg/g，總蛋白質(zhì)含量顯著低于除類群Ⅳ外的其他4個類群，清蛋白含量顯著低于其他5 個類群。類群Ⅳ包含37 份苦蕎種質(zhì)資源，種子谷蛋白含量均值最低，為23.91 mg/g，顯著低于其他5 個類群。類群Ⅴ包含20 份苦蕎種質(zhì)資源，種子球蛋白和谷蛋白含量均值最高，分別為17.35 mg/g和35.79 mg/g，球蛋白含量顯著高于其他5 個類群，谷蛋白含量顯著高于除類群Ⅰ外的其他4 個類群。類群Ⅵ包含35份苦蕎種質(zhì)資源，種子醇溶蛋白含量均值最高，為4.44 mg/g，顯著高于其他5個類型。

表5 苦蕎種質(zhì)資源各類群種子蛋白質(zhì)及其組分含量的方差分析Tab.5 ANOVA analysis of protein and its components contents of seeds among different groups of Tartary buckwheat

續(xù)表5 苦蕎種質(zhì)各類群蛋白質(zhì)及其組分含量的方差分析Tab.5（Continued） ANOVA analysis of protein and its components contents of seeds among different groups of Tartary buckwheat

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，231 份苦蕎種質(zhì)資源種子總蛋白質(zhì)含量為55.03～104.69 mg/g，變異系數(shù)為12.7%，總蛋白質(zhì)含量變化范圍和變異系數(shù)均低于GUO 等[11]對野苦蕎、四倍體苦蕎和鄭俊青等[12]對苦蕎遺傳群體的研究結(jié)果，表明遺傳背景對苦蕎種子蛋白質(zhì)含量影響較大。種子中4種蛋白質(zhì)組分含量存在不同程度的變異，變異系數(shù)均高于總蛋白質(zhì)含量，表現(xiàn)為清蛋白（24.5%）＞醇溶蛋白(24.2%)＞谷蛋白(19.6%)＞球蛋白(16.5%)，豐富的遺傳變異有利于各蛋白質(zhì)組分的極端種質(zhì)資源的篩選和遺傳變異機(jī)制研究。

苦蕎種子蛋白質(zhì)組分含量因基因型、產(chǎn)地、提取方法和提取條件的不同而有所差異。本研究中51.9%（120 份）的供試苦蕎種質(zhì)資源種子蛋白質(zhì)組分含量占比表現(xiàn)為清蛋白（43.9%）＞谷蛋白（34.8%）＞球蛋白（17.4%）＞醇溶蛋白（3.9%），這與張啟迪等[14]和吳穎[25]的研究結(jié)果一致；1份苦蕎種質(zhì)資源表現(xiàn)為谷蛋白（48.8%）＞球蛋白（24.2%）＞清蛋白（21.3%）＞醇溶蛋白（5.7%），這與朱慧等[26]的研究結(jié)果相符；有47.2%（109份）的供試苦蕎種質(zhì)資源表現(xiàn)為 谷 蛋 白（44.2%）＞清 蛋 白（33.1%）＞球 蛋 白（18.1%）＞醇溶蛋白（4.5%）。除了本研究的蛋白質(zhì)組分含量占比表現(xiàn)類型外，前人還報道了清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白[27]和谷蛋白＞清蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白[13]的類型。醇溶蛋白和谷蛋白是面筋蛋白質(zhì)的主要成分[19]，許多研究結(jié)果都表明苦蕎種子清蛋白含量高[14，25，27]、醇溶蛋白含量低[14，25?26]是導(dǎo)致苦蕎面條延展性較差的主要原因。本研究中苦蕎種子蛋白質(zhì)組分含量間的相關(guān)性分析表明，醇溶蛋白含量與清蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與谷蛋白含量呈顯著正相關(guān)，這表明醇溶蛋白與清蛋白的拮抗作用大于與谷蛋白的協(xié)同作用，較大程度提高苦蕎種子醇溶蛋白含量較困難，而搭配富含醇溶蛋白和谷蛋白的小麥粉是改善蕎麥面食加工特性的有效方法。

苦蕎種子蛋白質(zhì)各組分氨基酸的組成和功能特性不同。例如，清蛋白富含甲硫氨酸和賴氨酸，營養(yǎng)價值高[28]；球蛋白富含豐富的支鏈氨基酸，抗疲勞作用最顯著[29]；清蛋白降血脂能力最強(qiáng)，球蛋白次之，谷蛋白最弱[30]。本研究通過聚類分析將供試的231 份苦蕎種質(zhì)資源劃分為六大類群，獲得的各蛋白質(zhì)組分含量的極端類群為蛋白質(zhì)加工專用品種的選育提供了材料，也為蛋白質(zhì)組分含量變異機(jī)制研究提供了試驗材料。類群Ⅰ包含41份種質(zhì)資源，為高總蛋白質(zhì)、高清蛋白和高谷蛋白類型，可用于苦蕎高蛋白質(zhì)品種的遺傳改良。