李佳娣，趙勁捷，范海燕，朱曉峰，王媛媛，劉曉宇，段玉璽，陳立杰*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110866；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，沈陽 110866）

根結(jié)線蟲可引起作物根系癌腫，造成蔬菜減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)60%～70%，甚至絕收，在全球造成的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)10億美元，是世界上危害最嚴(yán)重的土傳病原物[1,2]。根結(jié)線蟲寄主范圍廣，可以通過病土、病苗、病殘體、農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播，常見種類南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita是我國溫室蔬菜作物的優(yōu)勢種類，一旦進(jìn)入溫室土壤中很難清除，成為世界上最難防控的土傳病害，也是困擾我國的蔬菜產(chǎn)業(yè)的重要生產(chǎn)問題。生物防治作為線蟲病害綜合治理措施中的一種環(huán)境友好型防治措施，近年來得到了發(fā)展[3,4]。

對根結(jié)線蟲有效的生防菌篩選主要集中在真菌和細(xì)菌的研究上，早期研究多集中在真菌上，人們發(fā)現(xiàn)了淡紫擬青霉[5]、木霉菌[6]和聚多曲霉[7]等線蟲生防真菌。近年來，又發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌[8]、蘇云金芽胞桿菌[9]、巨大芽胞桿菌[10]、防御假單胞菌[11]和堅強(qiáng)芽胞桿菌[12]等對根結(jié)線蟲有活性。

殺線活性物質(zhì)的生成是這些生防菌株發(fā)揮防病功能的重要機(jī)制之一，而活性物質(zhì)的種類、產(chǎn)量及生成效率直接影響菌株的實際生防效果。發(fā)酵是獲得大量殺線活性物質(zhì)的基礎(chǔ)，對菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可有效提高菌株的生防潛力。張潔等[13]分離到一株具有殺線活性的生防真菌粉紅螺旋聚孢霉NF-06，并以產(chǎn)孢量為指標(biāo)，優(yōu)化其固體發(fā)酵條件后可有效防治根結(jié)線蟲病。馬喆[14]對微白黃鏈霉菌NZ-5的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，其對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒殺活性提高到93.29%，比優(yōu)化前提高了8.93%。對淡紫擬青霉 KU8的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠提高其生物量，從而能更加有效地防治根結(jié)線蟲[15]。何瓊等[16]優(yōu)化日本曲霉ZW1的發(fā)酵條件，確定其最優(yōu)發(fā)酵條件，4 ℃保存一年的發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率保持在87.8%。柳皓月等[17]優(yōu)化芽胞桿菌SMrs28發(fā)酵條件，使該菌株分泌更多殺線蟲活性的物質(zhì)。Zhang等[18]通過響應(yīng)面法優(yōu)化長枝木霉菌T6的發(fā)酵條件，以其發(fā)酵濾液殺線蟲活性為指標(biāo)，優(yōu)化后T6菌株的殺線能力可達(dá)到92.42%，比優(yōu)化前提高了1.07%，并且在溫室試驗中對線蟲的生防效果達(dá)到了83.33%。

單一的生防菌株一旦進(jìn)入復(fù)雜的土壤環(huán)境，很難發(fā)揮良好的生防效果，因此，將2種或2種以上的微生物進(jìn)行共培養(yǎng)，從而利用種群之間的協(xié)同代謝或誘導(dǎo)作用來得到純培養(yǎng)條件下不能獲得的產(chǎn)量、性狀或新型物質(zhì)[19]；或者利用共培養(yǎng)技術(shù)來挖掘新型抗生物質(zhì)已經(jīng)成為一種重要的手段[20]。解淀粉芽胞桿菌Sneb709 Bacillus amyloliquefaciens[21]和費氏中華根瘤菌Sneb183 Sinorhizobium fredii[22]均為本實驗室前期篩選獲得的具有殺線蟲活性的生防菌株，本文將其進(jìn)行共培養(yǎng)研究，并優(yōu)化其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，旨在降低發(fā)酵成本、提高生防效果，為植物線蟲病害的綠色防控提供更加高效的生防制劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌Sneb709菌株和費氏中華根瘤菌Sneb183菌株，均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所篩選、鑒定并保存。

1.1.2 供試線蟲及其2齡幼蟲的制備 南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所南方根結(jié)線蟲繁殖基地繁殖。選取受到根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重的番茄根系品種Solanum lycopersicum L-402，購于遼寧園藝種苗有限公司，清洗干凈后，使用眼科鑷子挑取根結(jié)于裝有適量0.5% NaClO溶液的孵化池中，靜置1 min后使用無菌水沖洗3次，將孵化池裝入滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加入適量的無菌水，放入26℃暗室中培養(yǎng)，24 h收集南方根結(jié)線蟲J2s，用于殺線蟲活性測定試驗。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，加去離子水至1000 mL，pH 7.0。LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉18.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基。YMB培養(yǎng)基：酵母提取物1.0 g/L，甘露醇10.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，氯化鈣1.0 g/L，加去離子水至1000 mL，pH 6.8。YMA培養(yǎng)基：瓊脂18.0 g/L，其余同YMB培養(yǎng)基。

1.2 菌株活化與共培養(yǎng)發(fā)酵液制備

將Sneb709從-80 ℃取出接種于LB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，制備Sneb709種子液濃度為1×109CFU/mL。將Sneb183從-80 ℃取出接種于YMA平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落于5 mL YMB培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，制備Sneb183種子液濃度為1×109CFU/mL。取250 μLSneb709種子液與250 μL Sneb183種子液于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min、12 h，制備Sneb709與Sneb183共培養(yǎng)發(fā)酵液濃度為1×109CFU/mL。

1.3 共培養(yǎng)發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2s的毒殺活性鑒定

取濃度均為1×109CFU/mL 的Sneb709發(fā)酵液、Sneb183發(fā)酵液以及Sneb709與Sneb183共培養(yǎng)發(fā)酵液各2 mL，用0.22 μm濾膜過濾，分別取650 μL濾液于24孔板中，加入50 μL J2s懸液約1000條/mL，以無菌水、LB培養(yǎng)基、YMA培養(yǎng)基為對照，將其放置于26 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，12 h后在體式顯微鏡下（日本Nikon公司）觀察并記錄J2s的死亡數(shù)量，線蟲的死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為蟲體僵直，并且使用毛針刺激后依然不活動，則判定線蟲死亡。計算校正死亡率，共計5個處理，每個處理重復(fù)3次。線蟲死亡率（%）＝（處理線蟲死亡數(shù)－對照線蟲死亡數(shù)）×100/對照線蟲死亡數(shù)，線蟲校正死亡率（%）＝（處理線蟲死亡率－對照線蟲死亡率）×100/（100－對照線蟲死亡率）。共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液發(fā)酵條件單因素篩選

1.3.1 發(fā)酵液培養(yǎng)基成分單因素篩選 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入濃度均為1%的外源碳源、氮源、濃度為0.3%的外源無機(jī)鹽制備成不同培養(yǎng)基成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中外源碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、山梨糖、甘露醇、可溶性淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉；外源氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、黃豆粉、花生餅粉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、尿素；外源無機(jī)鹽包括硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

在不同成分的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種750 μL Sneb709與Sneb183共培養(yǎng)發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，每瓶中裝有150 mL液體LB培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h。取2 mL發(fā)酵液用0.22 μm濾膜過濾，取650 μL濾液于24孔板中，加入50 μL J2s懸液約1000條/mL，以無菌水以及LB培養(yǎng)基為對照，將其放置于26 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，12 h后觀察并記錄J2s的死亡數(shù)量，計算校正死亡率，共計28個處理，每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 影響發(fā)酵液培養(yǎng)條件單因素水平測定 用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，使發(fā)酵初始pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；在250 mL三角瓶分別裝入25、50、75、100、125、150 mL培養(yǎng)基；將接種后的發(fā)酵液分別以140、160、180、200、220 r/min在28 ℃培養(yǎng)12 h；將接種后的發(fā)酵液放于28 ℃、180 r/min的搖床中分別培養(yǎng)12、16、20、24、28、32、36 h。12 h后統(tǒng)計J2s的死亡數(shù)量，計算校正死亡率，每個處理重復(fù)3次。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化篩選共培養(yǎng)菌株殺線蟲活性的發(fā)酵因素

通過 Plackett-Burman試驗分析單因素中各因素中因子的差異顯著性，選取較為顯著因子。使用Desgin-Exper 8.0.6軟件Factorial中Plackett-Burman對1.3進(jìn)行設(shè)計。試驗結(jié)果用Desgin-Exper 8.0.6軟件進(jìn)行分析確定影響發(fā)酵結(jié)果的重要因素；再根據(jù)結(jié)果確定主要因素的爬坡方向。在主要影響因素中，在原始基礎(chǔ)上依次增加，以此設(shè)置最陡爬坡試驗。在最陡爬坡試驗中第1組：初始pH為5，裝液量為75 mL，在28 ℃下培養(yǎng)；第2組：初始pH為6，裝液量為100 mL，在30 ℃下培養(yǎng)；第3組：初始pH為7，裝液量為125 mL，在32 ℃下培養(yǎng)；第4組：初始pH為8，裝液量為150 mL，在34 ℃下培養(yǎng)

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，確定重要影響因子的響應(yīng)中心點。以南方根結(jié)線蟲J2s的校正死亡率為響應(yīng)值，同時在單因素試驗以及最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上,確定影響發(fā)酵結(jié)果的培養(yǎng)基成分為山梨糖、花生餅粉、黃豆粉三要素，影響發(fā)酵結(jié)果的培養(yǎng)條件為溫度、pH、裝液量三要素,使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面試驗，其中設(shè)置培養(yǎng)基成分三要素不同濃度，共計 17組處理，影響培養(yǎng)基發(fā)酵條件的三要素溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃）、pH（5、6、7）、裝液量 7（5、100、125 mL），共計 17組處理，使用Desgin-Exper 8.0.6軟件 Response Surface中 Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行因素優(yōu)化試驗，建立最佳發(fā)酵條件，并以1.3.1的方法驗證其響應(yīng)面法獲得的預(yù)測值。

1.5 優(yōu)化后的共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的毒殺活性

對比在優(yōu)化條件下培養(yǎng)的共培養(yǎng)發(fā)酵液和在未優(yōu)化條件即原始發(fā)酵條件下培養(yǎng)的共培養(yǎng)發(fā)酵液培養(yǎng)基，未優(yōu)化條件：培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為pH 7，在250 mL三角瓶中加入150 mL培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)在180 r/min條件下，發(fā)酵12 h，以無菌水、LB培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基為對照，驗證優(yōu)化后的共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的毒殺活性。按照1.3.1的方法進(jìn)行毒殺試驗，分別取2 mL共培養(yǎng)優(yōu)化發(fā)酵液和未優(yōu)化發(fā)酵液用0.22 μm水系濾膜過濾，以無菌水、LB培養(yǎng)基以及YMA培養(yǎng)基為對照。共計3個處理，每個處理重復(fù)3次。

1.6 發(fā)酵罐驗證優(yōu)化條件

在上海百倫科技5聯(lián)體離位滅菌機(jī)械攪拌玻璃發(fā)酵罐BLBIO-5GJ-5-H中使用共培養(yǎng)菌株在優(yōu)化條件和原始條件進(jìn)行發(fā)酵2個處理。優(yōu)化發(fā)酵條件，即將LB培養(yǎng)基中加入山梨糖1.98 g/L、黃豆粉1.06 g/L、花生餅粉2.08 g/L制備成培養(yǎng)基，在溫度為30.4 ℃、初始為pH 6.49、裝液量為2.063 L；原始條件，即LB為培養(yǎng)基中在溫度為28 ℃、初始為pH 7、裝液量為3 L，對兩種發(fā)酵液以1.3.1的方法進(jìn)行毒殺試驗，每個處理重復(fù) 3次。以無菌水以及LB培養(yǎng)基為對照，對使用發(fā)酵罐發(fā)酵對線蟲的毒殺作用進(jìn)行驗證。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft Office Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS statistics 23.0 軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，試驗采用Duncan 法P＜0.05進(jìn)行差異顯著性分析，使用GraphPad Prism 8.0.2作圖以及標(biāo)準(zhǔn)誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的毒殺活性測定

Sneb709與Sneb183共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s具有很強(qiáng)的毒殺活性，顯著高于純培養(yǎng)，其中Sneb709于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Sneb183于YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，純培養(yǎng)的培養(yǎng)基對J2s的活性影響不顯著，處理12 h后，菌株Sneb709和 Sneb183的發(fā)酵濾液對J2s的校正死亡率分別為58.33%和17.08%，而共培養(yǎng)的發(fā)酵濾液對J2s的毒殺活性最高，校正死亡率為67.67%（圖1）。

圖1 共培養(yǎng)菌株與純培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的影響Fig.1 Effect of co-cultured strain and pure culture strains culture filtrate on J2s of Meloidogyne incognita

2.2 兩種菌株共培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分的單因素篩選

通過共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的毒殺活性對發(fā)酵液培養(yǎng)基成分進(jìn)行單因素篩選結(jié)果顯示，碳源中山梨糖處理對J2s的校正死亡率達(dá)到78.16%，乳糖處理對J2s的校正死亡率為63.12%，山梨糖和乳糖的添加對J2s的影響較其他碳源影響顯著。氮源中尿素處理對J2s的校正死亡率最高可達(dá)72.70%，其次為花生餅粉處理，對J2s的校正死亡率為65.71%，酵母膏和黃豆粉處理對J2s的毒殺活性雖不及前兩個處理，但依然優(yōu)于其他氮源成分，校正死亡率分別為46.70%和56.86%。無機(jī)鹽中碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅處理對J2s的毒殺活性較高，校正死亡率分別為70.89%、70.20%、75.63%（圖2）。

圖2 不同培養(yǎng)基成分的共培養(yǎng)菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2s的影響Fig.2 Effects of co-cultured strain culture filtrate of different component mediums on J2s of M.incognita

2.3 兩種菌株共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件單因素發(fā)酵

通過單因素篩選并確定最優(yōu)培養(yǎng)條件的范圍（圖3），當(dāng)pH值為2.0、3.0、4.0、10.0時，共培養(yǎng)發(fā)酵液對J2s的毒殺作用接近100%，說明過酸或過堿的條件不利于線蟲生存；同時過酸或過堿的條件也不利于生防菌生存，在此條件下生防菌的濃度均不高于1×103CFU/mL；因此，這4個pH值條件不能選取為發(fā)酵生防菌的優(yōu)化條件。當(dāng)pH值為6.0時菌株，共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對J2s的效果最好，死亡率為80.22%；250 mL的三角瓶中裝液量為100 mL時的菌株共培養(yǎng)發(fā)酵濾液的毒殺活性最好，校正死亡率可達(dá)53.36%；此外，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到120 r/min時，對J2s的校正死亡率為47.15%；溫度為30 ℃時對J2s毒殺活性最好，校正死亡率為58.60%；當(dāng)發(fā)酵28 h后對J2s的校正死亡率最高可達(dá)47.91%。

圖3 不同培養(yǎng)條件的發(fā)酵液濾液對南方根結(jié)J2s的影響Fig.3 Effects of co-cultured strain culture filtrate on J2s of Meloidogyne incognita in different culture conditions

2.4 Plackett-Burman試驗確定影響共培養(yǎng)發(fā)酵液培養(yǎng)基成分重要因素

根據(jù)發(fā)酵液培養(yǎng)基成分的單因素試驗篩選結(jié)果，用Design expert 8.0軟件處理不同因素水平下的PB試驗設(shè)計（表1），并對12組結(jié)果（表2）分析各因素的顯著性，該模型P＝0.0485的可信度水平也高于95%（P＜0.05），可知該模型在0.05水平上顯著（表3）。因素E-花生餅粉P＝0.0122、D-黃豆粉P＝0.017和A-山梨糖P＝0.0419的可信度水平均高于95%（P＜0.05），說明這3個因素對共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液毒殺J2有顯著影響，其余因素可信度不高于95%，則說明其余因素對發(fā)酵液毒殺J2無顯著影響。7個因子影響大小排序為花生餅粉＞黃豆粉＞山梨糖＞尿素＞酵母膏＞硫酸鋅＞乳糖，故選取花生餅粉、黃豆粉和山梨糖進(jìn)行下一步試驗。

表1 共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分Plackett-Burman設(shè)計的因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design for co-culture medium components

表2 共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman test for co-culture medium components

表3 共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分各因素效應(yīng)值及其顯著性分析Table 3 Effect values of various factors in co-culture medium and their significance analysis

2.5 不同成分發(fā)酵液培養(yǎng)基響應(yīng)中心點確定

根據(jù)發(fā)酵液培養(yǎng)基成分的單因素試驗篩選結(jié)果，設(shè)置最陡爬坡試驗及路徑結(jié)果（表4）表明，共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)基組成成分為山梨糖1 g/L、黃豆粉1 g/L、花生餅粉2 g/L，對南方根結(jié)線蟲J2s的校正死亡率最高，為65.89%，因此選擇此點為響應(yīng)中心點進(jìn)一步進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗。

2.6 影響共培養(yǎng)發(fā)酵液培養(yǎng)條件重要因素及響應(yīng)中心的確定

根據(jù)不同培養(yǎng)基成分的單因素試驗篩選結(jié)果,用Design expert 8.0軟件對不同條件因素下的PB試驗分析各因素的顯著性，該模型（P＝0.0007）的可信度水平也高于95%（P＜0.05），可知該模型（P＜0.05）具有顯著影響性。因素K-溫度（P＝0.0004）、H-pH（P＝0.0029）和I-裝液量（P＝0.0006）的可信度水平均高于95%，說明這三個因素對共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液毒殺J2有顯著影響，其余因素可信度不高于95%，則說明其余因素對發(fā)酵液毒殺J2無顯著影響，并且該模型在0.01水平上極顯著（P＝0.0007）。5個因子影響大小排序為溫度＞pH＞裝液量＞時間＞轉(zhuǎn)速（表5）。

選取溫度、pH和裝液量進(jìn)行最陡爬試驗，設(shè)置4組不同培養(yǎng)條件（圖4）結(jié)果表明，在第2組的培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵對南方根結(jié)線蟲J2s的校正死亡率最高，為58.15%，因此選擇此點為響應(yīng)中心點進(jìn)一步進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗。

圖4 不同培養(yǎng)條件的發(fā)酵液濾液的最陡爬坡試驗對南方根結(jié)J2s的影響Fig.4 Effects of Steepest climb test e on J2s of Meloidogyne incognita in different culture conditions

2.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面試驗以及其試驗設(shè)計以及結(jié)果（表6）。通過軟件數(shù)據(jù)方差進(jìn)行分析，該模型在0.01水平上極顯著（P＝0.0015），并且其失擬項不顯著，由此可知，此模型的建立能夠涵蓋所有試驗數(shù)據(jù)，而由試驗誤差導(dǎo)致的不能擬合情況可以忽略（表7）。得到校正死亡率 Y與影響發(fā)酵的重要培養(yǎng)基成分因素山梨糖(A)、黃豆粉(D)、花生餅粉(E)的回歸方程：Y＝78.52－2.95A＋3.44D＋5.84E＋5.74AD＋8.11AE－1.20DE-10.12A2-13.29D2－17.21E2。

表6 共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Co-culture medium composition Box-Behnken test design and results

表7 共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分回歸方程模型系數(shù)評估及其顯著性檢驗Table 7 Coefficients of covariant medium composition regression equation model coefficients and significance test

通過對數(shù)據(jù)方差的分析得知該模型P＝0.0111，在0.05水平上顯著，并且其失擬項不顯著（表8），由此可知此模型的建立能夠涵蓋所有試驗數(shù)據(jù)，而由試驗誤差導(dǎo)致的不能擬合情況可以忽略。通過軟件進(jìn)行回歸擬合，得到校正死亡率%Y與影響發(fā)酵的重要培養(yǎng)條件因素溫度（K）、pH（H）、裝液量（I）的回歸方程：Y＝66.92＋5.64K＋7.01H＋3.78L＋0.072KH－4.60KL＋0.11HL－13.4K2－7.69H2－11.84I2。

根據(jù)方程模擬結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面曲線和登高線曲面圖都為凸面圖（圖5，6），說明有最高值，通過解析方程得到共培養(yǎng)發(fā)酵液毒殺活性最高時的培養(yǎng)條件：山梨糖0.98 g/L，黃豆粉1.06 g/L，花生餅粉2.08 g/L，溫度30.4 ℃；初始pH 6.49，裝液量103.15 mL。

圖5 共培養(yǎng)發(fā)酵液培養(yǎng)基成分對J2s校正死亡率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of the effects of co-cultivation broth media components on J2s corrected mortality

圖6 共培養(yǎng)發(fā)酵液培養(yǎng)基成分對J2s校正死亡率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of co-cultivation broth media components on J2s corrected mortality

2.8 優(yōu)化后共培養(yǎng)發(fā)酵液的殺線蟲效果

在優(yōu)化條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液對J2s的毒殺活性顯著高于未優(yōu)化共培養(yǎng)發(fā)酵濾液，在原始發(fā)酵條件下共培養(yǎng)處理12 h后對J2s的校正死亡率只有66.28%，優(yōu)化后的校正死亡率達(dá)到84.17%，是原始發(fā)酵未在優(yōu)化條件下的1.27倍（圖7）。

圖7 共培養(yǎng)發(fā)酵液在優(yōu)化條件下培養(yǎng)對南方根結(jié)線蟲J2s的影響Fig.7 Effect of co-culture fermentation broth on Meloidogyne incognita J2s under optimized conditions

2.9 利用發(fā)酵罐驗證優(yōu)化的發(fā)酵條件

利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并驗證其殺線蟲效果（圖8）。在發(fā)酵罐中，采用優(yōu)化條件來發(fā)酵的共培養(yǎng)發(fā)酵液濾液處理12 h 后對J2s的校正死亡率為74.03%，采用原始培養(yǎng)條件發(fā)酵的共培養(yǎng)發(fā)酵液對J2s的活性為50.31%。因此，優(yōu)化后的發(fā)酵條件應(yīng)用在發(fā)酵罐的發(fā)酵中，依然可以提高共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對J2s的毒殺活性，是采用原始條件發(fā)酵的1.47倍。

圖8 優(yōu)化條件下共培養(yǎng)菌液發(fā)酵液在發(fā)酵罐中對南方根結(jié)線蟲J2s的影響Fig.8 Effect of co-cultivation broth and fermentation broth on M.incognita J2s in fermenter under optimized conditions

3 討論

生防菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)，是其防病的重要機(jī)制之一，而活性物質(zhì)的含量與效率不僅菌株本身的遺傳特性相關(guān)，也受到發(fā)酵條件的影響[23]。不同的生防菌株對培養(yǎng)基營養(yǎng)以及發(fā)酵條件的需求不同，因此需要對特定的菌株篩選適宜的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件[24]。馬永強(qiáng)[25]對生防菌株GD-9發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化確定其最

適的培養(yǎng)條件為菌劑商品生產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。肖咪云等[26]通過單因素實驗和正交實驗對銅綠假單胞菌2016NX1的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，藍(lán)色素的產(chǎn)量由原來的1.13 g/L，提升至1.42 g/L。本試驗通過單因素優(yōu)化法、響應(yīng)面法BB設(shè)計對共培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，其對南方根結(jié)線蟲J2s的校正死亡率達(dá)到84.17%，是未優(yōu)化的1.27倍。

對生防菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可以提高其對線蟲病害的防治效果，Brand等[27]通過優(yōu)化淡紫擬青霉的固態(tài)發(fā)酵條件，提高其產(chǎn)胞量，從而提高對根結(jié)線蟲的防治效果。曾慶飛等[28]優(yōu)化鏈霉菌 DA07118發(fā)酵條件，優(yōu)化后的發(fā)酵濾液根結(jié)線蟲J2s死亡率從75.0%提高至93.7%。利用響應(yīng)面法可以更好的研究碳源、氮源、無機(jī)鹽等培養(yǎng)基成分之間的相互影響，并確定最佳發(fā)酵的值。Zhang等[29]確定芽胞桿菌Z-14最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：1.17%玉米粉，3.31%酵母，0.072% MnSO4·H2O，0.2% NaH2PO4·2H2O，0.4% Na2HPO4·2H2O。在最佳條件下發(fā)酵后，孢子產(chǎn)量達(dá)到1.85×109CFU/mL。

發(fā)酵過程中，菌株需要從環(huán)境中吸收碳源、氮源、無機(jī)鹽等一系列營養(yǎng)成分，而培養(yǎng)基成分的組成和配比對菌體生長發(fā)育、活性物質(zhì)產(chǎn)量、質(zhì)量和種類影響巨大。Suberu等[30]探究6種氮源、碳源對蠟狀芽胞桿菌ABBA1、枯草芽胞桿菌RD7和NRD9產(chǎn)生蛋白酶的影響，其中麥芽糖和牛肉膏對這三株生防菌的蛋白酶產(chǎn)生影響最大。Cheba等[31]在氮源對芽胞桿菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的研究中，通過對8中不同氮源的探究，發(fā)現(xiàn)0.5%的酵母提取物可大幅度提升幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量。本試驗篩選出山梨糖、黃豆粉、花生餅粉3個效果較好的因素，通過響應(yīng)面法確定其最優(yōu)配比為：山梨糖0.98 g/L，黃豆粉1.06 g/L，花生餅粉2.08 g/L，其對J2s的校正死亡率可達(dá)到65.89%。

改變培養(yǎng)條件影響生防菌的生長速率及其活性物質(zhì)的產(chǎn)量，Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)影響芽胞桿菌產(chǎn)生二乙酰最主要的培養(yǎng)條件是通氣速率，其次是轉(zhuǎn)速和溫度，二乙酰的最佳發(fā)酵條件為在37 ℃、0.6 vvm的條件下充氣，轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下，二乙酰的效價為7.12 g/ L。Ahmad等[33]將枯草芽胞桿菌分離菌株B4進(jìn)行分批發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵11 h時的生物量最大，為4.53 g/L。本研究發(fā)現(xiàn)pH、裝液量、溫度對共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液的殺線蟲活性具有顯著性影響在溫度30.4 ℃；初始pH 6.49，裝液量103.15 mL時其對J2s的校正死亡率可達(dá)到58.15%。

本試驗發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件能夠顯著提高共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲的毒殺活性，但尚需進(jìn)一步分離純化共培養(yǎng)菌株發(fā)酵液中主要的殺線蟲活性物質(zhì)并探究其對根結(jié)線蟲病害的生防機(jī)制，為生產(chǎn)中利用共培養(yǎng)生防菌發(fā)酵液防治根結(jié)線蟲病奠定堅實的研究基礎(chǔ)。