顧瓊楠,歐 翔,褚世海,黃啟超,陳安安,李儒海*
(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室,武漢 430064;2.中華人民共和國桂林海關,桂林 541004)
牛筋草Eleusine indica (L.) Gaertn.是農(nóng)田的一種惡性雜草,分布于中國南北各?。▍^(qū))及全世界溫帶和熱帶地區(qū),主要危害玉米、棉花、大豆等糧食作物,及蔬菜、果樹等經(jīng)濟作物[1]。使用化學除草劑是其主要的防除措施,然而隨著化學除草劑的大量使用,導致牛筋草抗藥性以及環(huán)境污染問題日益加重,牛筋草的高效安全防除面臨著嚴峻挑戰(zhàn),因此開發(fā)微生物除草劑或利用自然界生物中具有生物活性的代謝產(chǎn)物開發(fā)新的生物源除草劑成為高效防除牛筋草、進而替代現(xiàn)有化學除草劑的有效途徑之一[2]。
自然界中植物致病微生物-真菌是開發(fā)生物除草劑的重要來源[3]。目前,有超過40個屬的真菌已經(jīng)或正在被考慮開發(fā)成生物除草劑,其中包括刺盤孢菌屬 Colletotrichum、疫霉屬 Phytophthora、鐮刀菌屬Fusarium、交鏈孢菌屬Alternaria等[4]。其中,炭疽菌已應用于防除多種雜草[5],如膠孢炭疽菌菟絲子?;虲olletotrichum gloeosporiodes (Penz.) Sacc.f.sp.cuseutae的商品化除草劑“魯保一號”對大豆田菟絲子有明顯的防除效果[6]。盤長孢狀刺盤孢合萌?;虲.gloeosporioides f.sp.aeschynomene的商品化除草劑“Collego”能夠用來防除水稻及大豆田間生長的豆科雜草,如弗吉尼亞合萌等[7]。瓜類炭疽菌C.orbiculare可以用來防治澳大利亞牧羊區(qū)和灌溉作物中的雜草刺蒼耳[8]。禾谷炭疽菌C.graminicola菌株KA001可用來防除水稻田里的稗屬雜草[9]。盤長孢狀刺盤孢錦葵?;虲.gloeosporioides f.sp.malvae的商品除草劑“Bio Mal”主要用于防治圓葉錦葵[10]。豬毛菜炭疽菌C.gloeosporioides f.sp.salsolae可以用來防除北美地區(qū)農(nóng)田中的入侵性雜草豬毛菜或風滾草[11]。此外,平頭炭疽菌C.truncatum可以用來防治大果田菁[12]及巴西農(nóng)田雜草狼把草[13]。膠孢炭疽菌C.gloeosporioides可以防除夏威夷森林中的惡性雜草毛野牡丹藤[14]。蒲黃炭疽菌C.typhae有防治水生雜草香蒲的潛力[15]。雖然已有許多炭疽菌在雜草防除上的報道,但是利用炭疽菌防治牛筋草的報道較少。
為了進一步挖掘適合于湖北省牛筋草的生防菌資源,本研究前期從牛筋草植株上分離出一株強致病力炭疽菌菌株,通過形態(tài)學及分子生物學對該病原菌進行分類鑒定,并通過對病原菌的生物學特性、生防效果和作物安全性的評估,明確該菌的生物學特性,以期為研究牛筋草生物除草劑提供理論依據(jù)。
供試植株:牛筋草、稗、馬唐、大巢菜等雜草種子均為本實驗室采集并保存,反枝莧種子由南寧海關技術(shù)中心桂林分中心實驗室提供。玉米、小麥、水稻品種分別為鄂玉24、鄭麥9023及晚秈98。菌株NJC-16分離于湖北省武漢市江夏區(qū)金水農(nóng)場玉米田自然發(fā)病的牛筋草植株。
培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(Potato sucrose agar,PSA)培養(yǎng)基、燕麥瓊脂(Oatmeal agar medium,OA)培養(yǎng)基、燕麥番茄瓊脂(Oatmeal tomato agar medium,OTA)培養(yǎng)基、胡蘿卜瓊脂(Carrot agar medium,CA)培養(yǎng)基、綠豆汁(Mung bean agar medium,MBA)培養(yǎng)基、查氏(Czapek)培養(yǎng)基等基本配方參考方中達[16]的方法。
試劑及儀器:Green Taq Mix,南京諾唯贊生物科技公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Eppendorf Centrifuge 5810R,德國Eppendorf公司;Olympus IX81顯微鏡,日本Olympus公司;東勝ETC811 PCR擴增儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。
1.2.1 病原菌的分離及致病性測定 采用常規(guī)組織分離法分離病原菌,用清水洗凈病葉并剪取4 mm×4 mm的病健交界處組織,用75%乙醇處理30 s,0.1%升汞消毒1~2 min,無菌水沖洗3遍,接種在PDA培養(yǎng)基上,25 ℃下培養(yǎng)5 d,將獲得的菌株通過單孢純化后保存在PDA斜面及濾紙片上,分別置于4 ℃及-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
致病性測定采用菌絲塊離體接種及分生孢子液活體接種進行。菌絲塊接種:從三葉期健康牛筋草植株上選取大小一致的無病害葉片20片,70%酒精1 min進行表面消毒,打取直徑為5 mm的菌絲塊,接種至牛筋草健康葉片上;以接種PDA培養(yǎng)基作為對照,置于30 cm×50 cm的瓷盤內(nèi)25 ℃保濕培養(yǎng),接種2 d后移去菌絲塊,觀察發(fā)病情況。
分生孢子懸浮液活體接種:收集牛筋草炭疽菌的分生孢子,將分生孢子配成濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液。牛筋草植株種于10 cm的花盆中,每盆10~15株,將配制好的分生孢子懸浮液以10 mL/盆的接種量(含0.05%的吐溫80)均勻噴灑到3葉期的健康牛筋草植株上,以含0.05%的吐溫80的無菌水作對照,25 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后,16 h/8 h光/暗培養(yǎng),觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則,對發(fā)病葉片進行再分離、培養(yǎng),在顯微鏡下觀察分離得到的菌株是否為原接種菌株。
1.2.2 病原菌鑒定 病原菌形態(tài)學鑒定:將病原菌接種到 PDA、PSA平板上,25 ℃光照培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)、顏色、分生孢子及附著胞的特征等,參照《真菌鑒定手冊》[17]及Crouch等[18]的方法,對病原菌進行形態(tài)學的鑒定。
病原菌的分子鑒定:采用CTAB法提取病原菌株的基因組DNA。采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴增該病原菌的目的基因序列,引物均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應體系:PCR反應體系總體積為25 μL,反應液組分為:Green Taq Mix 12.5 μL(諾唯贊生物科技公司,南京),模板DNA 1 μL,引物ITS1和ITS4(25 μmol/L)各1 μL,加ddH2O使總體積達到25 μL,在東勝ETC811 PCR擴增儀上進行擴增。
擴增產(chǎn)物的測序委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行,所得到的核苷酸序列與 GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中序列進行BLAST比對分析,使用MEGA 7.0軟件將供試菌株的ITS序列與BLAST上同源性高的菌株序列進行比對,采用鄰近法(neighbor-joining,NJ)進行聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.3 菌株NJC-16的生物學特性測定 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響:將直徑為6 mm的菌絲塊,分別接至PDA、PSA、OTA、OMA、CA、MBA平板的中央,在25 ℃條件下培養(yǎng),7 d后觀察菌絲生長情況,并采用十字交叉法測量菌落直徑,并用5 mL的ddH2O洗平板,四層擦鏡紙過濾,對分生孢子進行計數(shù),每個處理5個重復。
溫度對病原菌生長的影響:將直徑為6 mm的菌絲塊,接至PDA平板中央,分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫條件下培養(yǎng),觀察菌絲生長情況,5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑,每處理5次重復。
光照對病原菌生長的影響:將直徑為6 mm的病原菌菌絲塊接至PDA平板中央,將平板分別置于連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱,25 ℃恒溫培養(yǎng),5 d后用十字交叉法測量菌落直徑,每處理5個重復。
pH對病原菌生長的影響:打取直徑為6 mm的菌絲塊,接至PDA平板中央, pH分別設為4、5、6、7、8、9和10,25 ℃恒溫條件下培養(yǎng),觀察菌絲生長情況,5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑,每處理5個重復。
碳、氮源對病原菌生長的影響:以查氏(Czapek)培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,用等質(zhì)量碳元素的葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、半乳糖、山梨醇、麥芽糖、檸檬酸鈉、果糖、乳糖替代蔗糖,以不加碳源的查氏培養(yǎng)液作為對照;用等質(zhì)量氮元素的酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉代替 KNO3,以不加氮源的查氏培養(yǎng)液作為對照。打取直徑為6 mm的菌絲塊接至含不同碳(氮)源的PDA平板上,25 ℃條件下培養(yǎng)7 d,十字交叉法測量菌落直徑,每處理5個重復。
病原菌菌絲致死溫度的測定:將直徑為6 mm的病原菌菌絲塊接至無菌試管中,加入2 mL滅菌水,置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的水浴中加熱10 min,每個處理5個重復,然后接種于PDA平板中央,25 ℃光照培養(yǎng),5 d后用十字交叉法測量菌落直徑,10 d后觀察菌落最終生長情況。
1.2.4 菌株NJC-16對不同雜草的防效 將菌株NJC-16接種于PSB培養(yǎng)基,25 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 d,收集分生孢子并配制成濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液(含0.05%的吐溫80)。每盆噴施10 mL分生孢子懸浮液于3葉期稗草、馬唐和反枝莧等雜草植株上,25 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后,16 h/8 h光/暗培養(yǎng)。以噴施0.05%的吐溫80的植株為對照,21 d后觀察植株的發(fā)病情況,統(tǒng)計發(fā)病率、致死率,并收集雜草地上部分,統(tǒng)計鮮重抑制率。每處理3個重復。
1.2.5 作物安全性測定 將濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液(含0.05%的吐溫80)噴施2~3葉期玉米、小麥和水稻植株,接種量及培養(yǎng)方法同1.2.4。接種7 d后,觀察供試玉米、小麥和水稻的發(fā)病情況。21 d后收集作物地上部分,統(tǒng)計鮮重抑制率,鮮重抑制率(%)=(對照平均鮮重-處理平均鮮重)/對照平均鮮重×100。
試驗數(shù)據(jù)采用DPS 15.10軟件和Excel進行統(tǒng)計分析,用最小顯著差數(shù)(LSD)法進行差異顯著性檢驗。
采用常規(guī)組織分離法對采集的病葉進行病原菌的分離。從分離的不同真菌中選擇代表性菌株進行致病性測定結(jié)果表明,只有接種代表菌株NJC-16時,牛筋草的葉片產(chǎn)生黑褐色輪紋狀病斑。
離體接種牛筋草葉片在25 ℃下保濕培養(yǎng)24 h后,葉片病斑初為水漬狀,隨發(fā)病時間延長逐漸擴展為黑褐色輪紋狀?;铙w接種分生孢子懸浮液的牛筋草植株在噴霧接種3 d后產(chǎn)生水漬狀病斑,后逐漸擴大并形成黑褐色輪紋狀病斑。2種接種方法產(chǎn)生的癥狀均與田間自然發(fā)病癥狀一致,從發(fā)病葉片上重新分離到的病原菌與原接種菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致,進一步確認菌株NJC-16為牛筋草的致病菌。
圖1 牛筋草炭疽菌田間發(fā)病癥狀及室內(nèi)接種癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose disease of goosegrass
對牛筋草病原菌菌株NJC-16進行了形態(tài)學上的鑒定,菌株NJC-16在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形,邊緣規(guī)則,絨狀,25 ℃培養(yǎng)條件下7 d菌落直徑為5.9 cm,菌落初期白色,后期為黑色(圖2A);在PSA培養(yǎng)基上菌落圓形,邊緣規(guī)則,呈絨狀,25 ℃培養(yǎng)條件下7 d菌落直徑為6.1 cm,菌落初期白色,后期為黑色,氣生菌絲較多(圖2B),菌絲有隔,透明,0.6~5.0 μm,有脂滴。
分生孢子無色,單孢,長橢圓狀或鐮刀狀,大小為(2.8~4.6)μm×(7.3~11.8)μm,分生孢子內(nèi)含脂滴(圖 2C)。附著胞圓形或長圓形,卵球形或倒卵球形或棒狀,邊緣光滑,少有葉瓣狀附著胞,大小為(4.3~6.0)μm×(6.7~11.6) μm(圖2D),初步通過形態(tài)學鑒定菌株NJC-16為子囊菌亞門腔孢綱黑盤孢目禾生炭疽菌復合種C.graminicola complex下的牛筋草炭疽菌C.eleusines。
圖2 生防菌NJC-16的形態(tài)特征Fig.2 Symptoms of NJC-16
分子鑒定采用通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增,得到554 bp大小的片段,將此片段在GenBank中進行 BLAST比對,發(fā)現(xiàn)該菌株與牛筋草炭疽菌(MAFF 511155)的同源性最高,為99.62%。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),菌株NJC-16序列與牛筋草炭疽菌遺傳距離最近,聚在一起(圖 3),結(jié)合形態(tài)學特征及分子鑒定結(jié)果,將菌株NJC-16鑒定為牛筋草炭疽菌。
圖3 基于ITS序列采用NJ法構(gòu)建菌株NJC-16及其相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NJC-16 and related strains based on ITS sequences by the NJ method
2.3.1 菌株NJC-16在不同培養(yǎng)基上的生長 將菌株NJC-16分別在PDA、PSA、OTA、OMA、CA及MBA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng),在OMA、PSA、PDA培養(yǎng)基上長勢最好,生長速度較快,培養(yǎng)7 d后菌落直徑分別為6.2、6.1和5.9 cm;但在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)孢有明顯差別,在OTA、MBA、PSA上產(chǎn)孢情況較好,產(chǎn)孢量分別為75×105、43×105和33×105孢子/皿,在CA、PDA、OMA固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較差(表1)。
表1 菌株NJC-16在不同培養(yǎng)基上的生長速率及產(chǎn)孢量Table 1 The growth rate and the sporulation of strain NJC-16 on different culture media
2.3.2 溫度、光照及pH對菌株NJC-16的生長影響 不同溫度對供試菌株菌絲生長的影響差異顯著。菌株NJC-16在20 ℃~30 ℃生長較好,其中25 ℃最適合菌絲生長,生長5 d后的菌落直徑達到45.0 mm;在5 ℃以下及35 ℃以上時,菌株NJC-16菌絲不生長(圖4)。
圖4 不同溫度對牛筋草炭疽菌菌絲生長的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth of the pathogen C.eleusines
不同光照條件對病原菌菌絲的生長影響不顯著。在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)5 d,菌落平均直徑分別為55.3、54.6、54.6 mm(圖5),無明顯差異。
圖5 不同光照條件對牛筋草炭疽菌菌絲生長的影響Fig.5 Effects of illumination on mycelial growth of the pathogen C.eleusines B
不同pH對供試菌株菌絲生長的影響差異顯著。菌株NJC-16在pH為4~10的培養(yǎng)基上均能生長,菌落直徑表現(xiàn)為先增加后減少,在pH為6~9時生長最好,當pH<5和pH>10時生長速率開始受到抑制(圖6)。
圖6 不同pH對牛筋草炭疽菌菌絲生長的影響Fig.6 Effects of pH on mycelial growth of the pathogen C.eleusines C
2.3.3 碳源和氮源對菌株NJC-16生長的影響 菌株NJC-16在10種不同碳源和7種不同氮源的培養(yǎng)基質(zhì)條件下都能夠生長,但對不同碳、氮源的利用程度不同。在不同碳源中,菌株 NJC-16對淀粉的利用效率最高,培養(yǎng)5 d后菌落直徑為8.35 cm,其次是葡萄糖和麥芽糖,而對檸檬酸鈉利用效果最差。在不同氮源中,菌株 NJC-16對酵母浸提液的利用效率最高,培養(yǎng)5 d后的菌落直徑為8.50 cm,其次為甘氨酸和蛋白胨,對氯化銨利用效果最差,生長緩慢(表2)。
2.3.4 病原菌的致死溫度 用不同溫度的水浴處理供試菌株的菌絲塊結(jié)果表明,菌絲塊在35 ℃~60 ℃水浴處理10 min后,置于PDA平板上培養(yǎng),5 d后均可長出菌絲,而經(jīng)65 ℃、70 ℃處理下,培養(yǎng)10 d后仍未觀察到菌絲生長,由此初步判斷病原菌菌絲的致死溫度為65 ℃、10 min。
將菌株NJC-16的分生孢子液分別接種于三葉期的牛筋草、稗草、馬唐、千金子、大巢菜、反枝莧等雜草植株。室內(nèi)生防試驗結(jié)果表明,菌株NJC-16分生孢子懸浮液對牛筋草生防效果最佳,接菌21 d后牛筋草發(fā)病率為83.2%,致死率達89.7%,鮮重抑制率達73.2%;對馬唐、千金子和反枝莧的生防效果較差,鮮重抑制率僅為5.8%、5.2%、9.4%;稗草雖然發(fā)病,但是卻不致死;接種大巢菜21 d后在大巢菜葉片上可見菌落,但致死率以及鮮重抑制率均不高(表3)。
將菌株NJC-16分生孢子液分別接種3葉期的玉米、小麥及水稻植株,室內(nèi)作物安全性試驗結(jié)果表明,在噴霧菌株NJC-16分生孢子液7 d后,玉米(鄂玉24)、小麥(鄭麥9023)和水稻(晚秈98)葉片均沒有明顯病斑;21 d后,玉米、小麥和水稻等作物鮮重沒有明顯的抑制,表現(xiàn)為安全(表4)。
表4 菌株NJC-16孢子液對不同作物的安全性比較Table 4 Comparison of the effect of NJC-16 strain spores on the safety of different crops
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)以極高的規(guī)模為人類提供高質(zhì)量的農(nóng)產(chǎn)品,這在一定程度上是通過合理使用農(nóng)藥來實現(xiàn)的,農(nóng)藥保護作物不受病蟲害的侵害、減少雜草的競爭,從而有助于保持作物的高產(chǎn)。然而,近年來因長期大量使用化學除草劑造成的環(huán)境污染和雜草抗藥性問題日益嚴峻,急需開發(fā)新的雜草管理方法[19]。隨著人們對植物病原菌研究的不斷深入,微生物除草劑的開發(fā)研究獲得了良好進展。從自然發(fā)病的雜草病株中篩選出來的植物病原菌具有較強的除草活性,因此有開發(fā)成為微生物除草劑的潛力。微生物除草劑具有對目標雜草選擇性高、環(huán)境負效應小、對作物安全性高等優(yōu)點,亦可以滿足全球?qū)τ袡C農(nóng)產(chǎn)品長期增長的需求[20]。
評價生物防治的潛力指標涉及菌株生物學特性、毒力水平等方面[21]。據(jù)報道,牛筋草炭疽菌在 PDA培養(yǎng)基上菌落生長和產(chǎn)孢均較好,在多種真菌培養(yǎng)基上均能生長,表明該菌對營養(yǎng)要求比較低[22]。在本研究中,牛筋草炭疽菌菌株NJC-16在PDA、PSA、OTA、MB等培養(yǎng)基上均能生長,在PSA上生長產(chǎn)孢較好,在以淀粉和酵母浸提液為碳、氮源的培養(yǎng)基上生長較好,這為低成本大規(guī)模人工培養(yǎng)提供了依據(jù)。另外,牛筋草炭疽菌對溫度適應性較廣,溫度對炭疽菌產(chǎn)孢、孢子的萌發(fā)及后續(xù)的侵染起著重要的作用。在不同的炭疽菌中,不同孢子的生長最適溫度也不近相同[23],香蕉炭疽病菌C.musae生長最適溫度為27 ℃~30 ℃[24],馬鈴薯炭疽病C.coccodes 生長最適溫度在20 ℃~30 ℃[25]。在本研究中,菌株NJC-16最適生長溫度和最適產(chǎn)孢溫度均為25 ℃~30 ℃,該菌的生長適合湖北省牛筋草生長期高溫、高濕的氣候。并且該菌對pH和光照條件均不敏感,在不同的pH及光照條件下產(chǎn)孢無明顯差異。綜上,在生物學特性上該菌株非常利于其在生物防治上的應用,是一種很有應用前景的植物病原真菌。
此外,獲得的牛筋草炭疽菌菌株 NJC-16能引起牛筋草發(fā)病,對牛筋草具有良好的防效。前人研究報道,在牛筋草上分離出幾種病原真菌,主要有牛筋草平臍蠕孢、狗尾草平臍蠕孢、香茅彎孢、長喙凸臍胞、灰梨孢等[26]。這些分離出的病原真菌不僅對牛筋草有致病性,對其他禾本科的雜草也有相應的致病性。對菌株NJC-16初步的寄主范圍測定表明對其他雜草如稗草、馬唐、反枝莧、大巢菜等雜草的防效一般,說明菌株 NJC-16對牛筋草有較好的寄主專一性。初步的生物安全試驗表明,該菌株不侵染玉米、小麥和水稻等大田作物,接種后不產(chǎn)生典型的水漬狀病斑,對以上作物的生物安全性較高。菌株NJC-16對牛筋草具有良好防效,同時對其他常見作物安全,因此有開發(fā)為牛筋草生防菌的潛力。
獲得一個有潛力開發(fā)為生物除草劑的生防菌株是開發(fā)生物除草劑的前提和基礎,但離成功開發(fā)一個商用的生物除草劑仍有許多工作要做。如牛筋草炭疽菌菌株NJC-16,需要進一步擴大寄主測定范圍,尤其對其在田間的使用進行安全評估。在后續(xù)工作中,還可以對該菌株進行基因改良,提高其產(chǎn)孢量及致病性。同時可對其發(fā)酵液中的活性物質(zhì)進行提取及鑒定,從該菌株中的天然產(chǎn)物入手,通過生物信息學等方法,有針對性地發(fā)現(xiàn)除草活性物質(zhì),鑒定其結(jié)構(gòu),以開發(fā)新的生物農(nóng)藥。