裴松松，吳 軒，李瑞軍*，趙 丹，陸秀君，郭 巍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

西花薊馬Frankliniella occidentalis隸屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella,是一種世界性的危險(xiǎn)性害蟲，廣泛分布于全球69個(gè)國(guó)家及地區(qū)[1]，也是我國(guó)第一批重點(diǎn)防治的外來入侵物種[2]。西花薊馬在取食和產(chǎn)卵過程中，不僅直接為害寄主植物，還可以傳播病毒病[3]，如鳳仙壞死斑病毒（INSV）、番茄斑點(diǎn)病毒（TSWV）、番茄紅斑病毒（TCSV）[4]和花生環(huán)斑病毒（GRSV）[5]，嚴(yán)重影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。西花薊馬的防治方法主要是農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治，其中化學(xué)防治是防治西花薊馬的主要手段。由于西花薊馬世代短，繁殖力高和孤雌生殖，以及大量化學(xué)殺蟲劑的使用已導(dǎo)致西花薊馬對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯和多殺菌素等多類殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[6,7]。

金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae是一種寄主范圍廣泛，對(duì)人畜、作物、害蟲天敵及自然環(huán)境相對(duì)安全的蟲生真菌[8]，其通過寄主體壁進(jìn)行主動(dòng)入侵感染，侵染過程包括寄主識(shí)別、附著孢分化、穿透體壁、免疫拮抗及體內(nèi)定殖等過程，由多因素作用導(dǎo)致寄主死亡，以達(dá)到防治害蟲的目的[9]。金龜子綠僵菌對(duì)西花薊馬的防治研究在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，Ansari等[10]研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌V275對(duì)西花薊馬的若蟲、蛹和成蟲均有較好的防治效果（致死率60%～90%），比化學(xué)農(nóng)藥吡蟲啉或氟蟲腈單獨(dú)使用效果更好；Mburu[11]測(cè)定了18株蟲生真菌的分離物對(duì)西花薊馬若蟲的毒力，研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌分離物ICIPE69的LT50最短，且分離物中分生孢子的數(shù)量最高；Maniania等[12]在田間試驗(yàn)中，比較了殺蟲劑樂果與金龜子綠僵菌對(duì)洋蔥上薊馬的防治效果，發(fā)現(xiàn)使用殺蟲劑和金龜子綠僵菌均降低了薊馬蟲口密度，每周使用金龜子綠僵菌最高產(chǎn)量為24000 kg/hm2，使用樂果產(chǎn)量最高為17000 kg/hm2。王興民等[13]測(cè)定了甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、多殺菌素、綠僵菌素（金龜子綠僵菌產(chǎn)生的一類環(huán)縮羧肽類毒素）對(duì)西花薊馬2齡若蟲的毒力，發(fā)現(xiàn)綠僵菌素對(duì)西花薊馬2齡若蟲的毒力最高。出于高效野生菌株的相繼分離和不同程度的田間防治效果，使人們對(duì)其寄予厚望。

我國(guó)是一個(gè)油料消費(fèi)大國(guó)，也是油料進(jìn)口大國(guó)?；ㄉ俏覈?guó)主要的油料作物之一[14]。西花薊馬自2003年傳入我國(guó)，已逐步蔓延至北京、云南、浙江、山東等地，本文采用室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效試驗(yàn)（試驗(yàn)場(chǎng)地為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)基地）的方法，研究金龜子綠僵菌對(duì)西花薊馬的防治效果，研究結(jié)果對(duì)西花薊馬的生物防治有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試蟲及菌株 供試西花薊馬為本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)飼養(yǎng)昆蟲，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期16L:8D[16]，于20 cm×20 cm×20 cm養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)，以新鮮四季豆飼喂，取成蟲備用；供試黃粉蟲為本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)飼養(yǎng)昆蟲，飼養(yǎng)條件（25±3）℃，于61 cm×41 cm×18 cm白色塑料盆飼養(yǎng)，以麥麩、新鮮蔬菜葉飼喂；供試23株金龜子綠僵菌采自河北及北京地區(qū)土樣以土壤誘集法獲得（表1），菌株保存與活化采用PDA培養(yǎng)基。

表1 供試金龜子綠僵菌的編號(hào)及地理來源Table 1 The serial number and origin of M.anisopliae for bioassays

1.1.2 田間試驗(yàn)藥劑 供試化學(xué)農(nóng)藥見表2，優(yōu)良菌株為試驗(yàn)中篩選得到的高毒力菌株F2-M18-8-4。

表2 試驗(yàn)中所用藥劑Table 2 Pesticides used in the test

1.2 菌懸液制備

將菌株培養(yǎng)7 d后，用刮孢子器刮下所有孢子，加入0.05%吐溫-80，在研磨器充分研磨后，倒入燒杯在漩渦振蕩器上震蕩3 min，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成1×108個(gè)孢子/mL的菌懸液備用。

1.3 金龜子綠僵菌的初篩

采用浸蟲法，用鑷子將黃粉蟲在菌懸液中浸沒3 s，放入墊有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理15頭試蟲，重復(fù) 3次；試蟲在人工氣候箱飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期 16L:8D；連續(xù)10 d、每日記錄死蟲數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡率、毒力。

1.4 高毒力金龜子綠僵菌菌株誘變選育

以初篩獲得高毒力菌株為出發(fā)菌株，將出發(fā)菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d待其產(chǎn)孢，用0.05%吐溫-80配制成1×108個(gè)孢子/mL的孢子菌懸液，梯度稀釋至1×106個(gè)孢子/mL。在超凈工作臺(tái)中，用功率15W的紫外燈預(yù)熱30 min，取10 mL菌懸液加到直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中置于磁力攪拌器上，距紫外線光源30 cm，照射5 min。取0.1 mL菌懸液到PDA培養(yǎng)基上均勻涂開，置于（25±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，從最早發(fā)病死亡的僵蟲上分離、純化得到菌株作為F1代菌株，繼續(xù)按照上述方法，獲得F2代菌株。

1.5 金龜子綠僵菌室內(nèi)毒力測(cè)定

參照濾紙藥膜法[17]，剪一片長(zhǎng)方形無菌濾紙浸沒在菌懸液中，取出后自然風(fēng)干放入長(zhǎng)10 cm，直徑2 cm的塑料指形管中，將西花薊馬成蟲移至指形管中并放入適量新鮮四季豆，以1×108個(gè)孢子/mL為濃度，測(cè)定了金龜子綠僵菌M18-8-4及其2株誘變菌株對(duì)西花薊馬的毒力。以0.05%吐溫-80為對(duì)照，每個(gè)處理15頭試蟲，3個(gè)重復(fù)。每24 h觀察一次存活狀態(tài)，連續(xù)觀察10 d，以軟毛毛筆輕觸蟲體無反應(yīng)判斷為死亡，記錄死蟲數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)、毒力。試蟲飼養(yǎng)同1.3。

1.6 田間藥效試驗(yàn)

種植花生品種為冀花-16，于4月中旬播種，穴間距為15 cm，行距為40 cm，花生生育期為苗期，試驗(yàn)期間不施用任何其他化學(xué)藥劑。

將固液雙相發(fā)酵獲得的孢子粉，用含有0.05%吐溫-80的水制成菌懸液。金龜子綠僵菌以藥液用量30 L/667 m2噴霧，3種農(nóng)藥按照表2的用量。

試驗(yàn)前西花薊馬發(fā)生嚴(yán)重，每百穴（墩）花生西花薊馬蟲口量達(dá)1000頭左右。試驗(yàn)設(shè)4種藥劑處理，以清水作為常規(guī)對(duì)照；每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，共15個(gè)小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)排列，每小區(qū)面積約30 m2。6月21日傍晚，以電動(dòng)式噴霧器均勻噴霧。施藥前1 d及施藥后3 d、7 d、10 d、15 d，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查5墩花生，記錄西花薊馬的蟲口量，同時(shí)調(diào)查花生新葉的受害程度。

花生葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，復(fù)葉葉片完好，無被害狀；1級(jí)，復(fù)葉葉片受害面積0＜x＜6%；3級(jí)，復(fù)葉葉片受害面積6%≤x＜26%；5級(jí)，復(fù)葉葉片受害面積26%≤x＜51%；7級(jí)，復(fù)葉葉片受害面積51%≤x＜76%；9級(jí)，復(fù)葉葉片受害面積x≥76%[18]。

測(cè)產(chǎn)試驗(yàn)于花生收獲前1 d進(jìn)行調(diào)查，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)1 m2，稱量并記錄莢果重量[19]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 17.0軟件對(duì)室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19-21]。

受害指數(shù)＝∑（各級(jí)受害葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高被害級(jí)）×100；保葉效果（%）＝（施藥前受害指數(shù)—施藥后受害指數(shù)）/施藥前受害指數(shù)×100；校正保葉效果（%）＝(施藥區(qū)保葉效果—清水對(duì)照區(qū)保葉效果)/（100—清水對(duì)照區(qū)保葉效果）×100；蟲口減退率（%）＝（施藥前蟲口數(shù)量—施藥后蟲口數(shù)量）/施藥前蟲口數(shù)量×100；校正蟲口減退率（%）＝（處理區(qū)蟲口減退率—對(duì)照區(qū)蟲口減退率）/（100—對(duì)照區(qū)蟲口減退率）×100；增產(chǎn)效果（%）＝（藥劑處理區(qū)產(chǎn)量—清水對(duì)照區(qū)產(chǎn)量）/清水對(duì)照區(qū)產(chǎn)量×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 金龜子綠僵菌的初篩

空白對(duì)照的黃粉蟲在 10 d的平均自然死亡率為 0，菌株 M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114造成黃粉蟲累計(jì)死亡率達(dá)到100%（圖1），顯著高于其他菌株對(duì)黃粉蟲的累計(jì)死亡率。生測(cè)中的蟲尸在保濕培養(yǎng)下，絕大部分蟲體在死亡2～3 d內(nèi)長(zhǎng)出白色菌絲，隨時(shí)間延長(zhǎng)，蟲體逐漸布滿綠色孢子。

各菌株對(duì)黃粉蟲的致死中時(shí) LT50在 3.68～19.36 d，不同菌株對(duì)黃粉蟲的毒力差異顯著，其中菌株M18-8-4的致死中時(shí)LT50最短，為3.68 d，雖然菌株M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114對(duì)黃粉蟲的累計(jì)死亡率也為100%，但致死中時(shí)LT50較長(zhǎng)。其他菌株LT50顯著長(zhǎng)于M18-8-4對(duì)黃粉蟲的LT50（圖1）。通過初篩，選擇致病力最高的菌株M18-8-4為優(yōu)良菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 23株金龜子綠僵菌對(duì)黃粉蟲10 d的累積死亡率和致死中時(shí)（平均值±SD）Fig.1 Cumulative mortalities and LT50 of 23 isolates against the T.molitor after 10 d treatment (Mean±SD)

2.2 金龜子綠僵菌對(duì)西花薊馬的毒力測(cè)定

金龜子綠僵菌M18-8-4及其紫外線誘變獲得的F1、F2代菌株對(duì)西花薊馬成蟲的毒力由高到低依次為菌株F2-M18-8-4、F1-M18-8-4、M18-8-4，致死中時(shí)分別為2.13 d、2.67 d、2.78 d（表3）。表明，誘變菌株F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬成蟲毒力高于其他菌株對(duì)西花薊馬成蟲毒力。因此，選擇菌株F2-M18-8-4作為田間藥效試驗(yàn)的高毒力菌株。

表3 出發(fā)菌株和誘變菌株對(duì)西花薊馬的毒力測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of toxicity test of starting strain and mutant strain to F.occidentalis

2.3 對(duì)西花薊馬的田間防治效果

2.3.1 對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率 為驗(yàn)證金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4的防治效果，以田間防治西花薊馬常用3種化學(xué)農(nóng)藥為參照，進(jìn)行田間藥效對(duì)比試驗(yàn)。4種處理對(duì)西花薊馬均有一定防治效果。施藥3 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率顯著低于3種化學(xué)農(nóng)藥，吡蟲啉、噻蟲嗪和乙基多殺菌素對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率分別達(dá)到66.48%、56.15%、62.47%；施藥7 d、10 d后，各處理對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率無差異，金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率分別為67.19%、68.73%；施藥15 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率顯著高于3種化學(xué)農(nóng)藥，為79.52%（表4）?？梢婋S著時(shí)間的延長(zhǎng)，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率呈上升趨勢(shì)。

表4 各處理對(duì)西花薊馬施藥后不同天數(shù)的校正蟲口減退率Table 4 The corrected decrease rate of F.occidentalis on different days after different treatments application (%)

2.3.2 對(duì)花生的校正保葉效果 金龜子綠僵菌F2-M18-8-4和3種化學(xué)藥劑對(duì)花生校正保葉效果如表5所示。施藥3 d后，吡蟲啉和噻蟲嗪對(duì)花生的校正保葉效果最高，分別為48.18%、42.01%，與金龜子綠僵菌F2-M18-8-4校正保葉效果有顯著差異；施藥10 d后，吡蟲啉對(duì)花生的校正保葉效果最高，達(dá)61.76%，其次為金龜子綠僵菌F2-M18-8-4和噻蟲嗪，校正保葉效果分別為58.61%、56.02%；施藥15 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4的校正保葉效果最高，達(dá)63.58%，其次為乙基多殺菌素58.11%，吡蟲啉和噻蟲嗪校正保葉效果較差。

表5 各處理施藥后不同天數(shù)對(duì)花生的校正保葉效果Table 5 Corrective peanut leaf protection rate at different days after different treatments application

2.3.3 不同處理防治西花薊馬對(duì)花生增產(chǎn)效果 金龜子綠僵菌F2-M18-8-4防治西花薊馬花生的產(chǎn)量最高，為6034.20 kg/hm2，增產(chǎn)效果為9.09%；其次是乙基多殺菌素處理的產(chǎn)量為5940.90 kg/hm2，增產(chǎn)效果為7.40%，兩者間差異不顯著。吡蟲啉和噻蟲嗪處理增產(chǎn)效果較差，與金龜子綠僵菌處理間有顯著差異，與乙基多殺菌素處理間差異不顯著（表6）。

表6 不同處理防治西花薊馬后對(duì)花生的增產(chǎn)效果Table 6 Effect of different treatment on peanut production by controlling F.occidentalis

3 討論

利用黃粉蟲篩選蟲生真菌是一種經(jīng)典的篩選方法，在初篩中毒力及死亡率均較高的M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19等菌株中，菌株M18-8-4對(duì)暗黑鰓金龜Holotrichia parallela、西花薊馬、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、花生蚜Aphis medicaginis和甜菜夜蛾Spodoptera exigua等花生田主要害蟲均顯示較高毒力，本文主旨報(bào)道誘變菌株 F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的防治效果，其他試驗(yàn)結(jié)果將另行報(bào)道。誘變后的真菌，其在人工培養(yǎng)基傳代后生物學(xué)性狀和殺蟲活性的穩(wěn)定性都是值得關(guān)注的問題，也是保證后續(xù)研究應(yīng)用的前提，本試驗(yàn)紫外線誘變后，選取生長(zhǎng)性狀好的單菌落經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行毒力測(cè)定，再?gòu)亩玖Ω?、僵蟲菌絲致密、分生孢子產(chǎn)量大的蟲體上分離、純化新菌株，以確保其毒力、抗紫外線能力及生長(zhǎng)特性穩(wěn)定。

西花薊馬是典型的多食性害蟲，可為害包括豆科植物花生在內(nèi)60多個(gè)科500多種植物[22]，對(duì)花生的產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[14]。田間害蟲調(diào)查中發(fā)現(xiàn)西花薊馬、花生蚜和甜菜夜蛾3類害蟲，其中以西花薊馬種類數(shù)量最多且危害嚴(yán)重，每百墩花生西花薊馬蟲口量達(dá) 1082頭，目前，西花薊馬已對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生不同程度的抗性，萬巖然等[23]發(fā)現(xiàn)在北京地區(qū)與室內(nèi)敏感品系相比，西花薊馬田間種群對(duì)多殺菌素的抗性倍數(shù)達(dá)到80～150倍；對(duì)乙基多殺菌素抗性倍數(shù)高達(dá)7730倍；對(duì)乙基多殺菌素的LC50值5年間最高增加了258倍；對(duì)甲維鹽和噻蟲嗪具有中等水平抗性；對(duì)阿維菌素和蟲螨腈處于敏感或低水平抗性。故此，田間害蟲發(fā)生時(shí)應(yīng)優(yōu)選生物防治，如殺蟲真菌金龜子綠僵菌[10-13,24,25]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[26,27]，捕食性天敵昆蟲巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri[28,29]、南方小花蝽Orius similis Zheng[30,31]等都應(yīng)用于防治西花薊馬。金龜子綠僵菌對(duì)西花薊馬有較高毒力，Taro[25]發(fā)現(xiàn)在室內(nèi)條件下，不同菌株引起的死亡率為 0～15.98%，表明篩選高毒力菌株是提高防治效果的主要途徑。本試驗(yàn)通過生測(cè)和紫外誘變，選育得到對(duì)西花薊馬毒力較高的金龜子綠僵菌F2-M18-8-4。以3種化學(xué)農(nóng)藥為對(duì)照，田間藥效試驗(yàn)表明，施藥10 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率達(dá)68.73%，與3種化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)，施藥15 d后，金龜子綠僵菌無論在對(duì)西花薊馬的校正蟲口減退率還是對(duì)花生的保葉效果上，均顯著高于3種化學(xué)農(nóng)藥。試驗(yàn)結(jié)果顯示，金龜子綠僵菌防治西花薊馬有較好的應(yīng)用前景，生產(chǎn)上可與化學(xué)農(nóng)藥交替、輪換使用，以減少化學(xué)農(nóng)藥殘留并延緩害蟲抗藥性的發(fā)展。

在田間應(yīng)用過程中，紫外線、溫度和濕度都會(huì)影響綠僵菌的防治效果，綠僵菌在較強(qiáng)紫外線的照射下會(huì)失去活力[32]。本試驗(yàn)選擇在傍晚施菌，避開了較強(qiáng)的日光直射，為孢子萌發(fā)提供較適宜的環(huán)境條件。西花薊馬對(duì)于寄主植物的危害是多方面的,僅僅用蟲口數(shù)量不能充分反映其影響[33]；綠僵菌可以兼治寄主植物的多種害蟲[34]，如果每一種都調(diào)查蟲口減退情況，工作量將十分巨大；本試驗(yàn)以保葉效果評(píng)價(jià)各處理的防治效果，不僅減少了田間工作量，還可以綜合評(píng)價(jià)各處理總的保護(hù)作物的效果。

在田間試驗(yàn)中，基于金龜子綠僵菌侵染、發(fā)病過程，在施藥初期金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4對(duì)西花薊馬的防治效果顯著低于化學(xué)農(nóng)藥。有相關(guān)研究表明，綠僵菌與某些化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用，可以提高防治效果[35]，我們將繼續(xù)研究金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4與化學(xué)農(nóng)藥協(xié)同使用的方式和效果，以期提高防治西花薊馬的效果。