崔 珂 孔亞茹 馬傳敏 張振杰 史衛(wèi)峰 全傳松

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，山東濟(jì)南 250014

腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）屬于小RNA 病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬。EV71 主要感染5 歲以下兒童，是導(dǎo)致重癥手足口病（hand，foot and mouth disease）最常見的病毒類型之一［1］。手足口病患者在臨床上表現(xiàn)為手、足、口部皰疹，咽峽炎等癥狀；少數(shù)重癥患者甚至出現(xiàn)心肌炎、腦膜炎或弛緩性麻痹等多種并發(fā)癥［2］。根據(jù)法定傳染病報(bào)告顯示，2020 年中國大陸共報(bào)告手足口病761 355 例，死亡3人，發(fā)病率為54.233 6/10萬［3］。該病毒持續(xù)引起國內(nèi)外公共衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，然而其防治仍未取得重要進(jìn)展［4］。

腸道病毒71 型可編碼VP1 ～VP4 4 種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白［5-6］，其中VP1 ～ VP3位于病毒衣殼表面。目前已證實(shí)VP1 的線性表位免疫原性較強(qiáng)，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［7-8］。在病毒感染過程中，機(jī)體通過體液免疫來阻止病毒的傳播，這在抗EV71 感染過程中發(fā)揮重要作用［9］。本研究選取EV71 抗原性強(qiáng)的VP1 蛋白，將其基因克隆至原核表達(dá)載體pET-21a（+）中，利用IPTG 誘導(dǎo)VP1蛋白在大腸埃希菌中融合表達(dá)，以純化的重組蛋白作為抗原，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選已免疫滅活病毒小鼠的B 淋巴細(xì)胞，這為篩選高效活性的抗EV71 抗體奠定了基礎(chǔ)，為臨床疾病的診斷和治療提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EV71 毒株KY315729、原核表達(dá)載體pET-21a（+）均由實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞BL21-DE3購自北京康為世紀(jì)公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；IPTG購自索萊寶生物科技有限公司；Superdex 75購自 GE 公司；6×His 抗體購自上海生工；GSSG 購自Amresco；弗式完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自Sigma；紅細(xì)胞裂解液購自索萊寶；CD19 PerCp-Cy5.5購自BD；Anti-his APC熒光抗體購自美天旎。

1.2 原核表達(dá)載體

pET-21a（+）-VP1 的構(gòu)建：將EV71基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，由蘇州金唯智生物公司進(jìn)行合成，并克隆到pET-21a上（雙酶切位點(diǎn)：5′BamHI和3′XhoI）。

1.3 重組VP1蛋白的表達(dá)、提取及純化

1.3.1 包涵體提取 將重組質(zhì)粒pET-21a（+）-VP1轉(zhuǎn)化到BL21-DE3 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落于37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入1000 mM IPTG，并在37 ℃、4～6 h 條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)離心和超聲破碎菌體后，取沉淀進(jìn)行洗滌、離心、重懸，用SDSPAGE及Western blot鑒定其包涵體純度。

1.3.2 目的蛋白的復(fù)性純化 根據(jù)等電點(diǎn)分析，摸索確定最佳復(fù)性pH。將包涵體滴加到復(fù)性緩沖液（100 mM Tris-HCl、400 mM L-Arg HCl、2 mM EDTA、5 mM GSH、0.5 mM GSSG、0.5 mM PMSF）中4 ℃過夜。將復(fù)性液濃縮、離心后取上清加入AKTA純化儀中，用分子排阻色譜法純化，收集蛋白并分析峰圖。

1.4 小鼠免疫

將滅活病毒（56 ℃，30 min）用等量的弗氏完全佐劑乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射方式，免疫6～8周齡昆明小鼠5只。初次免疫14天和28天后再次免疫，免疫劑量與初次免疫相同，但用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后14天取脾臟，采用紅細(xì)胞裂解的方式制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，純化后的細(xì)胞凍存至液氮中備用。

1.5 EV71 VP1特異性B細(xì)胞的檢測

利用制備好的EV71 VP1 蛋白分析小鼠脾臟特異性B 淋巴細(xì)胞。首先復(fù)蘇凍存的脾細(xì)胞，計(jì)算出VP1 及抗體用量；再向脾細(xì)胞中加入VP1 蛋白，4 ℃避光孵育 30 min；后用 CD19 和 Anti-his 抗體標(biāo)記細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min；最后用AF700熒光染料標(biāo)記出死細(xì)胞，借助BD FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果通過FlowJo-V10軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體 pET-21a（+）-VP1 的構(gòu)建

將EV71 VP1 基因密碼子優(yōu)化后合成，并構(gòu)建到pET-21a。酶切后的目的基因與預(yù)期結(jié)果片段大小相符（雙酶切位點(diǎn)為Scal 和Xhol）（圖1），測序分析序列正確。

圖1 限制酶切電泳結(jié)果

2.2 重組VP1蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

2.2.1 包涵體提取 將重組表達(dá)載體pET-21a（+）-VP1 轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21-DE3 中，加入1000 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，重組VP1蛋白以包涵體形式表達(dá)。取沉淀洗滌、離心、重懸后，經(jīng)SDS-PAGE 及Western blot 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，存在大小約為37 kDa 的目的條帶，與重組蛋白VP1 的大小相符，即包涵體成功提取（圖2）。

圖2 包涵體SDS-PAGE分析

2.2.2 目的蛋白的復(fù)性純化與抗原性驗(yàn)證 經(jīng)試驗(yàn)摸索，EV71 VP1蛋白最佳復(fù)性pH為7.9。利用分子排阻色譜的方法，將復(fù)性的包涵體純化，收集目的蛋白并分析峰圖。純化VP1重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，單一目的條帶清晰可見，說明純化效果好。測定蛋白質(zhì)濃度為0.16 mg/mL，將其置于－80 ℃保存。將所提取重組蛋白通過Western blot進(jìn)行抗原性驗(yàn)證，一抗為6×His抗體時(shí)（如圖4A），與對(duì)照相比，重組蛋白在37 kDa附近存在目的條帶，即EV71 VP1蛋白成功提取。當(dāng)一抗為免疫小鼠血清時(shí)（如圖4B），與未誘導(dǎo)菌相比，重組蛋白在37 kDa左右出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符，證明所提取的重組蛋白能夠和免疫小鼠的血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖3 純化蛋白收集的峰圖和鑒定

圖4 重組蛋白抗原性分析

2.3 EV71 VP1特異性B細(xì)胞的檢測

利用流式細(xì)胞儀對(duì)免疫組和PBS 組目的細(xì)胞亞群檢測發(fā)現(xiàn)，滅活病毒免疫小鼠的脾臟細(xì)胞中CD19及Anti-his雙陽性的細(xì)胞比例比PBS對(duì)照小鼠高（圖5A），免疫組陽性率平均為1.67%，而PBS 組僅為0.68%（P＜ 0.001）（圖5B），這表明滅活病毒免疫小鼠脾臟中病毒特異的B細(xì)胞比例顯著增加。

圖5 EV71 VP1特異性B細(xì)胞的檢測

3 討 論

EV71 引起的手足口病是一種常見的急性傳染病，發(fā)病率高，傳播快，流行廣，嚴(yán)重危害公眾健康［10-11］。但目前臨床無特異性的治療方法，EV71 傳播過程和病理學(xué)的細(xì)節(jié)也尚未完全明確［12］，如EV71 感染過程中存在的抗體依賴的增強(qiáng)作用具體機(jī)制尚不清楚［13］。目前許多研究證實(shí)EV71 VP1 蛋白與入侵宿主和抗體中和相關(guān)［14-16］，VP1 結(jié)構(gòu)蛋白具有良好的抗原性。除此之外，該蛋白的改變還與病毒的毒力和致病性密切相關(guān)?；诖耍緦?shí)驗(yàn)將EV71 VP1 核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，合成并構(gòu)建到重組表達(dá)載體pET-21a，后將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21-DE3 中。通過優(yōu)化重組蛋白表達(dá)和復(fù)性的條件，確定IPTG 誘導(dǎo)的最佳條件為1000 mM IPTG，最佳復(fù)性pH 為7.9。本實(shí)驗(yàn)利用稀釋復(fù)性及分子排阻色譜的方法，將復(fù)性的包涵體純化，并進(jìn)行抗原性驗(yàn)證。結(jié)果表明，所制備的重組VP1 蛋白能夠和病毒免疫小鼠的血清反應(yīng)，即具有良好的抗原性。利用EV71 VP1 蛋白檢測滅活病毒免疫小鼠脾臟病毒特異B 細(xì)胞，結(jié)果顯示該病毒特異性B 細(xì)胞比例顯著增加。該制備的抗原蛋白與流式檢測相結(jié)合，分選免疫動(dòng)物或者病毒感染患者體內(nèi)特異性漿細(xì)胞，為獲得抗體輕重鏈的序列奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突