高 潔， 黃燕云， 張雨彤， 杜相欣， 張利娜， 郝 娜， 郭 霞， 李建國， 張 宇△

(1. 山西醫(yī)科大學細胞生理學教育部重點實驗室， 2. 山西醫(yī)科大學生理學系， 太原 030001)

在進行腦片膜片鉗實驗時，經(jīng)常需要甄別實驗中選取的是哪一類細胞。通常是根據(jù)目標區(qū)域中細胞的鏡下形態(tài)、細胞的靜息電位及一些電生理學特性來進行初步的鑒別和區(qū)分。本實驗室采用了一種通過全細胞膜片鉗技術對腦片上目標神經(jīng)元實施熒光標記的方法。該方法在記錄離子通道電流后經(jīng)過處理就可以更直觀呈現(xiàn)觀察神經(jīng)元胞體和部分突起的形態(tài)，為實驗提供形態(tài)學的證據(jù)。

實驗中用到的兩種染色生物制劑分別為NeurobiotinTMTracer和Streptavidin-Texas Red。神經(jīng)生物素(Neurobiotin)是生物素的一種氨基衍生物，可作為細胞尤其是神經(jīng)元的胞內(nèi)標記物，使神經(jīng)結(jié)構(gòu)及其連接呈現(xiàn)可視化。神經(jīng)生物素溶解度高，被離子導入性好，無毒可在細胞內(nèi)長時間維持，因此它被廣泛應用于通過細胞內(nèi)記錄技術對細胞進行電生理學表征后，從形態(tài)上鑒定神經(jīng)元[1-3]。鏈霉親和素(Streptavidin)是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為65 kD，是一種稍偏酸性(pH 6.0)的蛋白質(zhì)。一個鏈霉親和素分子可以結(jié)合4個生物素分子。鏈霉親和素與生物素有很高的結(jié)合活性，因此被廣泛用于檢測生物素或生物素偶聯(lián)的各種蛋白、核酸及其它分子。溶解的鏈霉親和素可以在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，且特異性高[4]。被Texas Red標記的鏈霉親和素可與Neurobiotin結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。Texas Red標記的鏈霉親和素的發(fā)射波長(Em)為602 nm，激發(fā)波長(Ex)為582 nm。本文中以大鼠皮層和海馬錐體神經(jīng)元為樣本介紹腦片膜片鉗實驗中標記所記錄神經(jīng)元形態(tài)的具體染色方法，為進行電生理學檢測的神經(jīng)元提供形態(tài)學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

取出生10～20 d健康雄性SD大鼠(購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心)；4%多聚甲醛；0.01 mol/L 磷酸緩沖液(PB)； NeurobiotinTMTracer產(chǎn)自美國Vectorlabs公司，Streptavidin-Texas Red產(chǎn)自美國Invitrogen公司；Triton X-100產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司，戊巴比妥鈉、NaHCO3、KCl、NaH2PO4、NaCl、CaCl2、MgSO4、HEPES、Glucose、EGTA、K-Gluconate、Na2phosphocreatine、Na2ATP、Na3GTP和Mg-ATP均產(chǎn)自美國Sigma公司，帶芯微電極玻璃管GBF150-86-10HP產(chǎn)自美國Sutter公司。

1.2 腦片制備

溶液配制：切片液(mmol/L)含NaHCO326，KCl 2.5，NaH2PO41.25，CaCl20.5，MgSO47，HEPES 5，Glucose 10，Sucrose 210，pH 7.2～7.4，滲透壓295～205 mOsm/kg，4℃保存；孵育液(mmol/L)含KCl 2.5，CaCl22，NaH2PO41.25，NaCl 124，NaHCO326，Glucose 10，pH 7.2～7.4，滲透壓295～205 mOsm/kg，現(xiàn)配現(xiàn)用；電極內(nèi)液含K-Gluconate 120，KCl 5，HEPES 10，EGTA 5，CaCl20.5，MgSO42，Na2phosphocreatine 5，Na2ATP 5，Na3GTP 4，Mg-ATP 4，pH 7.2～7.4，滲透壓295～205 mOsm/kg，用1.5 ml的EP管分裝，每管1 ml，-20℃保存；含有神經(jīng)生物素的電極內(nèi)液為1 ml的電極內(nèi)液中加入50 μg的NeurobiotinTMTracer粉末(5%)，然后用1.5 ml的EP管分裝，每管25 μl，-20℃保存；4%的多聚甲醛(pH 7.2～7.4)；0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2～ 7.4)。

制備離體腦片：健康雄性SD大鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后快速被斷頭取腦，置于4℃氧飽和(95%O2和5%CO2)的切片液中冷卻十幾秒后取出。用Precisionary Instruments VF-700振動切片機進行腦片標本制備。沿冠狀面修切掉不需要的部分，再用502膠水將其粘于振動切片機配套的組織托柄上，并用瓊脂固定，然后迅速將其置于切片槽中并倒入4℃切片液，浸沒腦組織塊，調(diào)整好刀片和組織的距離后開始切片。切片機震動頻率為7，前進速度為3，腦片厚度為200 μm。沿冠狀面每切出一片腦片，就將其迅速轉(zhuǎn)移到室溫(25℃)孵育液中。切片液和孵育液中都持續(xù)通混合氣(95%O2和5%CO2)。切好的腦片孵育1 h后即可觀察記錄。

1.3 神經(jīng)元的染色標記

膜片鉗記錄模式下染料灌注：將孵育好的腦片移至腦片膜片鉗設備的記錄槽中，并用尼龍蓋網(wǎng)固定。將拉制好的玻璃電極尾端浸入含有神經(jīng)生物素的電極內(nèi)液中，利用虹吸作用使尖端充灌標記液后，尾端注入不含神經(jīng)生物素的電極內(nèi)液。將電極安裝在電極夾持器上，然后利用微型操縱器使其緩慢下降，在快接近腦片時給少許正壓。選擇輪廓清晰，胞體較亮，折光性好的細胞，當電極接觸到細胞表面時撤去正壓，并施加適當負壓，使電極尖端與細胞表面形成高阻封接(GΩ)。待封接穩(wěn)定后再次給予負壓使細胞破膜形成全細胞記錄模式。撤去負壓，將放大器設置到whole-cell模式進行膜片鉗電生理記錄。若細胞的靜息電位大于-50 mV，則表明細胞狀態(tài)良好，可繼續(xù)記錄。根據(jù)實驗需求，使用事先編輯好的Protocal或采用Gap-free模式進行記錄。每個細胞至少記錄10 min以上，使電極內(nèi)液中的神經(jīng)生物素充分進入細胞中。每片腦片上標記1～3個神經(jīng)元。腦片標記完后置于4%多聚甲醛中常溫下固定2 h以上(若腦片厚度超過200 μm，可酌情延長時間，也可4℃過夜)。

神經(jīng)元染色與觀察：固定好的腦片用0.1 mol/L的PB震蕩漂洗3次，每次5 min。在PB中加入 0.1%的Triton X-100(一種非離子型表面活性劑，溶解脂質(zhì)，以增加染料細胞膜的通透性)和0.1%的液體染料(如5 ml的PB中加入5 μl Triton X-100和5 μl Streptavidin-Texas Red)避光震蕩混勻2 h以上，再用PB漂洗2次后即可用熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元的膜片鉗記錄

用全細胞腦片膜片鉗法，對大鼠前扣帶皮層及海馬部位的錐體神經(jīng)元采用電壓鉗和電流鉗模式，記錄神經(jīng)元在不同電壓刺激下膜電流的變化的反應和不同電流刺激下膜電壓的變化反應，如圖1所示。電壓鉗模式記錄時，鉗制電壓為-70 mV，通過記錄電極給一系列階躍刺激(從-50～+90 mV，階躍10 mV，時程200 ms)。錐體神經(jīng)元表現(xiàn)為逐漸增大的膜電流。電流鉗模式記錄時，階躍刺激(從-30～+60 pA ，增幅為10 pA，時程200 ms)使神經(jīng)元去極化，達到閾電位后爆發(fā)動作電位。

Fig. 1 Whole-cell patch clamp recording results. The above showed that the recorded membrane potential in the anterior cingulate cortical neuron (A) and the hippocampal neuron (C), and the recorded currents in the anterior cingulate cortical neuron (B) and the hippocampal neuron (D), n=5

2.2 神經(jīng)元的染色

經(jīng)過上述全細胞膜片鉗記錄及染色后，所選細胞的形態(tài)如圖2。錐體神經(jīng)元的胞體直徑約20～40 μm，圖中可看到清晰的胞體和周圍的突起，表明神經(jīng)生物素NeurobiotinTMTracer及其親合物Streptavidin-Texas Red可用作標記神經(jīng)元。

Fig. 2 The fluorescent photographs of pyramidal neurons labeled with intracellular fluid containing NeurobiotinTM Tracer in a 15-day-old rat. Neurons were stained with the pipette solution for a period of 20 min(n=5)；The left is the anterior cingulate cortical neuron, the right is the hippocampal neuron

3 討論

標記單個神經(jīng)元的理想示蹤劑必須滿足多個要求，例如快速擴散，組織學處理過程中的穩(wěn)定性等。NeurobiotinTM是一種有效的神經(jīng)解剖學示蹤劑，可用于體內(nèi)順行、逆行和跨神經(jīng)元描記，以及體外標記神經(jīng)元[5-7]。但也有研究表明，使用充滿神經(jīng)生物素的電極，尤其是膜片鉗電極，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的電生理特征有所影響，會給所獲得的電生理數(shù)據(jù)的解釋帶來問題，如在使用膜片鉗技術記錄期間，示蹤劑導致動作電位時程顯著延長，且與濃度有關，其影響隨記錄時間的增加而增大，但不明顯改變靜息膜電位等其他膜特性[8-10]。針對這一問題，本實驗選擇電極尖端充灌含有NeurobiotinTM的細胞內(nèi)液，電極尾部注入普通電極內(nèi)液，盡量減少生物素染料的使用量以減少對細胞電學特征的影響。另外，有實驗室使用這種標記方法標記神經(jīng)元時，為了避免移出電極時損傷細胞膜，采用減小玻璃微電極尖端直徑的辦法，但是高電阻尖端非常細小，易碎且容易堵塞，因此不易獲得并保持穩(wěn)定的細胞內(nèi)記錄[11]。經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，當電極尖端阻抗為5～7 MΩ時，實驗中既不影響細胞內(nèi)記錄，實驗結(jié)束后緩慢將電極從細胞上移除，也不易破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，有利于呈現(xiàn)完好的胞體和突起形態(tài)。

另外，實驗時還需要注意以下幾點：(1)配制液體的時候，一定要注意調(diào)節(jié)好液體的滲透壓和pH值，液體的理化性質(zhì)對腦片活性很關鍵；(2)切腦片的速度要快，從斷頭開始到腦片切好，整個過程不超過15 min，且時間越短腦片活性越好，染出來的細胞形態(tài)越接近真實狀態(tài)，突起也會越明顯；(3)細胞破膜后，可適當給予電刺激，有助于神經(jīng)生物素在胞內(nèi)擴散；(4)細胞記錄完成以后，緩慢撤出電極，避免速度過快、幅度過大會損傷細胞膜，導致染料外漏甚至細胞死亡；(5)由于神經(jīng)生物素對動作電位有影響，因此記錄動作電位的數(shù)據(jù)僅供參考，不適合收入正式結(jié)果中；(6)普通熒光顯微鏡可以清晰觀察細胞形態(tài)，但如果用激光共聚焦顯微鏡觀察效果更好。

以上是本研究室在腦片上記錄通道電流時標記目標神經(jīng)元形態(tài)的方法及操作體會。通過該方法實現(xiàn)了將膜片鉗技術與直觀的神經(jīng)元形態(tài)標記相結(jié)合，有利于甄別和區(qū)分中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同類型神經(jīng)元的功能活動，實用性強，易于在膜片鉗實驗中應用。