樊小群， 李 歡， 朱華雄， 黃健平， 何呂芬

(海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 三亞 572000)

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在全球范圍內(nèi)已90%以上的結(jié)腸癌患者死亡[1]，盡管改良的篩查技術(shù)和先進(jìn)的治療方法有助于提高患者的生存率，但是仍沒(méi)有一種完善方案的治療結(jié)腸癌[2]。因此亟需探索新型控制結(jié)腸癌的治療策略。近年來(lái)越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤的代謝途徑可有效抑制腫瘤發(fā)生，而6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是糖代謝過(guò)程重要的酶之一，在腫瘤的生存中發(fā)揮重要作用[3]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類小的非編碼RNA，通過(guò)靶向mRNA降解或翻譯抑制來(lái)控制基因表達(dá)[4]，mir-335-5p作為結(jié)腸癌抑制因子的作用已被證實(shí)[5]。然而，mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制生長(zhǎng)增殖、凋亡的機(jī)制是否與G6PD相關(guān)尚未清楚。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，探究mir-335-5p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡的影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和結(jié)腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IEC)均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，miR-335-5p mimic質(zhì)粒、miR-335-5p NC質(zhì)粒購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)并合成購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因(miR-335-5p模擬物序列為5'-UACAGUACUGUGAUAACUG AA-3'，模擬陰性對(duì)照(NC)序列為5 '-GTTCTCCGAAAACGTGTCACGT-3')，Lipofectamine 3000(貨號(hào)L3000001)、PCR試劑盒(貨號(hào) 14966005)均購(gòu)自于美國(guó)ThermoFisher公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)K1622)購(gòu)自于美國(guó)Fermentas公司，Trizol(貨號(hào)46301)購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)E2920)購(gòu)自于美國(guó)promega公司，熒光素酶報(bào)告載體由上漢恒生物公司提供，抗體G6PD(貨號(hào)ab993)、抗體Bcl-2(貨號(hào)ab185002)、抗體Bax(貨號(hào)ab32503)均購(gòu)自于美國(guó)abcom公司，MTT試劑盒(貨號(hào)M1025 )購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀(型號(hào)TECAN spark)購(gòu)自于帝肯(上海)貿(mào)易有限公司，電泳儀(型號(hào)1658001)購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司。熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI9700 )購(gòu)自于美國(guó)ABI公司

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人源性結(jié)腸癌細(xì)胞SW480與正常結(jié)腸細(xì)胞IEC分別接種于含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)，10%FBS 1640培養(yǎng)基中，放置于37℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，制備細(xì)胞懸液，接種于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)染及分組

設(shè)置正常結(jié)腸癌細(xì)胞組、空白對(duì)照組、NC組、miRNA-335-5p mimic組；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SW480，消化，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml，每孔1 ml鋪于6孔板，將空白對(duì)照組、NC組、miRNA-335-5p mimic組按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)分別用不含血清的培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1-NC質(zhì)粒和pcDNA3.1-miR-335-5p mimic質(zhì)粒(125 μl)與Lipofectamine 3000混合均勻，對(duì)NC組、miRNA-335-5p mimic組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，空白對(duì)照組每孔250 μl加無(wú)血清的培養(yǎng)基。37℃靜置20 min，分別加入6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，以每孔2 ml更換新鮮完全養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-335-5p、G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)

取培養(yǎng)48 h正常結(jié)腸細(xì)胞及空白對(duì)照組、NC組、miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，分別用TrIzol從中提取總RNA，根據(jù)引物合成軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物序列如(表1)所示，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA合成cDNA，并擴(kuò)增，按照定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性15 min、95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)，分別以U6、GAPDH為對(duì)照，分析miR-335-5p、G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct表示。

Tab. 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

分別構(gòu)建含有野生型G6PD 3′-UTR和突變型G6PD 3′-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(Wt-G6PD 3′-UTR：5'-GGAATTCACCATGGCAGAGCAGGTGGCCCT-3'和Mut-G6PD 3′-UTR：5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATC-3')。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，用含10%FBS和1%雙抗的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105cells/well，接種于24孔板中，將335-5p mimic或NC分別與Wt-G6PD 3′-UTR質(zhì)粒和Mut-G6PD 3′-UTR質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至共轉(zhuǎn)染至腸癌細(xì)胞SW480，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明對(duì)熒光素酶活性測(cè)定。

1.7 MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性

1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在避光條件下每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度5 mg/ml)，放入孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO放于搖床震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后在酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處各孔的OD值。按照相同的方法測(cè)定轉(zhuǎn)染后48 h、72 h處各孔的OD值，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析各組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性情況。細(xì)胞生長(zhǎng)活性=轉(zhuǎn)染組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡

1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，按照Annex-in V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。右上象限C2為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限C4為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率即為(C2+C4)%。

1.9 Western blot檢測(cè)G6PD及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，每組細(xì)胞PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量30 μg，上樣后進(jìn)行蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，轉(zhuǎn)膜，加入抗體G6PD，Bax，Bcl-2(均1∶500稀釋)孵育，放置4℃過(guò)夜，TBST清洗，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST清洗后，參考ECL發(fā)光液說(shuō)明書(shū)對(duì)條帶孵育、曝光、顯影。Image J對(duì)條帶灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miR-335-5p、G6PD mRNA表達(dá)水平的比較

與正常結(jié)腸細(xì)胞相比，空白對(duì)照組、NC組結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞中miR-335-5p相對(duì)表達(dá)水平降低，G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-335-5p mimic組細(xì)胞中miR-335-5p相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Relative expression levels of mir-335-5p and G6PD mRNA in cells of each n=6)

2.2 miR-335-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖能力影響

與空白對(duì)照、NC組相比，同一時(shí)間miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表3)。

Tab. 3 Effects of over expression of mir-335-5p on proliferative activity of SW480 cells(%, n=6)

2.3 miR-335-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡能力的影響

與空白對(duì)照(9.21±3.26)%、NC組(10.76± 4.29)%相比，轉(zhuǎn)染48 h后miR-335-5p mimic組 (51.10±6.34)%結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05，圖1)。

Fig. 1 Flow cytometry results of SW480 cell apoptosis in each group

2.4 miR-335-5p與G6PD存在靶向作用

miR-335-5p mimic+WT-G6PD 3′-UTR組(1.69±0.13)%熒光素酶相對(duì)活性低于miR-335-5p NC+WT-G6PD 3′-UTR組(2.47±0.22)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-335-5p mimic+MUT-G6PD 3′-UTR組(2.40±0.29)%與miR-335-5p NC+MUT-G6PD 3′-UTR組(2.44±0.33)%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 miR-335-5p過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞SW480中G6PD蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-335-5p mimic組G6PD、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，圖2，表4)。

Fig. 2 Expressions of G6PD and apoptosis related proteins in SW480 cells by over expression of mir-335-5p

3 討論

結(jié)腸癌是一類發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤，臨床上主要是通過(guò)手術(shù)治療、放療和化療相結(jié)合的方法治療結(jié)腸癌[6、7]，但是仍達(dá)不到預(yù)期的效果，因此研究治療結(jié)腸癌新的靶點(diǎn)成為目前研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。miRNAs是非編碼RNA，可與多靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合不完全，增強(qiáng)其降解和抑制其翻譯功能[8-10]。mir-335-5p是與癌癥相關(guān)的miRNAs之一，研究發(fā)現(xiàn)mir-335-5p由基因組區(qū)域染色體7q32.2轉(zhuǎn)錄而來(lái)，受DNA甲基化的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡的調(diào)控表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸細(xì)胞相比，mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中表達(dá)顯著降低，提示mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中低表達(dá)。為進(jìn)一步研究mir-335-5p在結(jié)腸癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Lipofectamine 3000向結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-335-5p mimic組細(xì)胞中miR-335-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，提示在成功建立miR-335-5p過(guò)表達(dá)模型，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

結(jié)腸癌細(xì)胞SW480具有無(wú)限增殖能力，研究發(fā)現(xiàn)mir-335-5p表達(dá)缺失可導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生，推測(cè)mir-335-5p可調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞增殖活性[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照、NC組相比，同一時(shí)間miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著降低，提示miR-335-5p過(guò)表達(dá)可降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長(zhǎng)活性。研究表明mir-335-5p可誘導(dǎo)乳腺癌，胃癌等癌細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡基因，和細(xì)胞中促凋亡基因Bax處于一定平衡狀態(tài)，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間。Caspase-3是線粒體細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一種重要酶，是細(xì)胞凋亡過(guò)程的重要執(zhí)行者，其過(guò)表達(dá)可加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照、NC組相比，轉(zhuǎn)染48 h后miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示miR-335-5p過(guò)表達(dá)能提高結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率，促使Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p在骨肉瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用截然相反[16]，推測(cè)不同腫瘤中miR-335-5p調(diào)控的靶基因不同，從而激活相應(yīng)的信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同作用。已知G6PD是戊糖磷酸途徑中限速酶，為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖提供核糖和NADPH，是維持細(xì)胞分裂增殖的重要物質(zhì)[17]。研究發(fā)現(xiàn)G6PD水平在黑色素瘤、白血病和乳腺癌等多種腫瘤中較高[18-20]，許多數(shù)據(jù)表明G6PD水平升高與結(jié)腸癌發(fā)生呈正相關(guān)。另有研究證實(shí)G6PD在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量高于正常細(xì)胞，可為腫瘤細(xì)胞提供能量[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸細(xì)胞相比較，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，提示，G6PD在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)。另外，與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-335-5p mimic組G6PD mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，提示miR-335-5p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)降低G6PD表達(dá)影響SW480細(xì)胞增殖、凋亡。進(jìn)一步經(jīng)由生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan. org/vert_72/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，G6PD是miR-335-5p的靶基因之一，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，WT-miR-335-5p mimic+G6PD 3′-UTR組的熒光素酶相對(duì)活性低于WT-miR-335-5p NC+G6PD 3′-UTR組，提示miR-335-5p能夠靶向G6PD，調(diào)控其表達(dá)。

綜上所述，上調(diào)miR-335-5p可能通過(guò)靶向G6PD，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，本研究不僅為結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制研究提供進(jìn)一步的參考，還在臨床治療或?yàn)榻Y(jié)腸癌的診斷提供理論依據(jù)以及潛在治療靶點(diǎn)有重要價(jià)值。但miR-335-5p可能存在多個(gè)靶基因，且結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程較為復(fù)雜，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

Tab. 4 Overexpression of mir-335-5p on G6PD and apoptosis related proteins in SW480 n=6)