張 瑜， 路青華， 曹海芳， 張生榮， 王虎德

(1. 青海省第四人民醫(yī)院肝病一科， 2. 科教科， 西寧 810000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以肝臟脂類代謝異常，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪類物質(zhì)蓄積過多而呈現(xiàn)彌漫性的肝脂肪變性為主要病理特征的一類臨床綜合征[1]。目前，NAFLD的發(fā)病機制包括胰島素抵抗、線粒體功能障礙、炎癥因子、氧化應(yīng)激等，其中胰島素抵抗被認(rèn)為是NAFLD病理生理基礎(chǔ)的中心環(huán)節(jié)，而炎癥細(xì)胞因子是影響胰島素敏感性的重要因素[2]。有研究表明，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體的形成，可介導(dǎo)IL-1β和IL-18的分泌，從而引起肝脂肪變性和胰島素抵抗，參與NAFLD的發(fā)病過程[3]。

G蛋白偶聯(lián)受體81(G protein-coupled receptor 81，GPR81)是乳酸受體，其功能異常通常與肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)[4]。據(jù)報道，GPR81可調(diào)節(jié)炎癥，下調(diào)關(guān)鍵的促炎癥基因，從而發(fā)揮抗炎作用[5]。研究指出GRP81可負(fù)性調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，具有抑制炎癥激活和器官損傷的作用[6]。然而目前對于GPR81調(diào)控NLRP3炎癥小體在NAFLD中的作用研究較少，因此本研究通過探討過表達GPR81對NAFLD大鼠胰島素抵抗的作用，并初步闡明其作用機制，作為NAFLD新的治療手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、建模及分組

選擇清潔級SD雄性大鼠30只，8～12周，體重200～240 g，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所(合格證號：SCXK(滇)K2016-0001)。將動物隨機分為3組，對照組、模型組(NAFLD)、GPR81激動劑組(NAFLD+GPR81激動劑)，每組10只。對照組：基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；NAFLD組：用高脂飲食建立大鼠脂肪肝模型。根據(jù)參考文獻[7]，NAFLD組給予改良高脂飼料(80%的基礎(chǔ)飼料+20%蔗糖)建立脂肪肝模型，造模12周；NAFLD+GPR81激動劑組：自造模開始，每周給予腹腔注射GPR81特異性乳酸激動劑(50 nmol/L)，每周1次，共12周。對照組及NAFLD組每周給予腹腔注射等量生理鹽水，每周1次，共12周。造模12周后麻醉處死取大鼠肝臟及外周血。

1.2 實驗主要試劑

GPR81激動劑(Sigma公司)；DAB顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、β-actin普通PCR上下游引物(上海生工公司)；NLRP3兔抗鼠單抗(美國Abcam公司)；ASC兔抗鼠單抗、caspase-1兔抗鼠單抗、IRS-1兔抗鼠單抗、GLUT4兔抗鼠單抗、抗羊抗Tyr抗體、抗兔抗Ser抗體、山羊抗兔、兔抗山羊二抗(均購自美國Santa Cruze公司)；大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和大鼠白細(xì)胞介素-18(interleukin 18，IL-18)ELISA試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

血糖儀(德國羅氏診斷公司)；全自動生化分析儀(日本Olympus)；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；Z216MK型冷凍離心機(德國HERMLE公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)；石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.4 肝生化指標(biāo)、空腹血糖及胰島素檢測

采用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransfease，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransfease，AST)；采用血糖儀檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、采用ELISA檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，計算公式[8]：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.5 采用HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變

將肝組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.6 采用ELISA法檢測各組大鼠肝組織及血清中細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達水平

將肝組織按體重體積比1∶9加入生理鹽水在冰浴中充分研磨，制成10%肝勻漿，然后5 000 r/min離心15 min取上清；采集大鼠外周血，2 500 r/min離心15 min取上清；根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，使用波長450 nm酶標(biāo)儀檢測光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出各組大鼠肝勻漿及血清中IL-1β和IL-18的表達水平。

1.7 采用Western blot檢測肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、Tyr465-IRS-1、Ser636-IRS-1、GLUT4的蛋白表達

取肝組織加入RIPA 裂解液裂解后提取肝組織中總蛋白，每組按40 μg蛋白上樣量經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h；分別加入一抗(1∶500稀釋)，孵育12 h；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity One軟件成像及定量分析。

1.8 采用qRT-PCR法檢測肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表達水平

Trizol法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測各組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4基因的表達水平。引物由上海生工公司設(shè)計合成，引物設(shè)計見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每個樣本重復(fù)檢測3次。以β-actin為內(nèi)參，每組基因的相對表達量按公式(2-△△Ct法)計算。

Tab. 1 Primer sequences for amplification of various genes by PCR

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝生化指標(biāo)、空腹血糖及胰島素的比較

與對照組相比，NAFLD組大鼠血清肝生化指標(biāo)TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動劑組大鼠血清TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著降低(P<0.05，表2)。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的比較

光鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠肝臟形態(tài)正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，細(xì)胞中央有大而圓的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)均勻；NAFLD組大鼠肝細(xì)胞體積增大，排列不規(guī)則，可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞有脂肪滴，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤；GPR81激動劑組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較NAFLD組明顯減輕，脂肪滴及炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖1)。

Tab. 2 Liver biochemical indexes, fasting blood glucose and insulin in each group n=10)

Fig. 1 Histopathology of liver in each group (HE ×200)

2.3 各組大鼠肝組織中NLRP3信號通路相關(guān)基因的蛋白表達的比較

NAFLD組肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表達與對照組相比顯著升高，而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動劑組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表達水平顯著降低而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表達顯著升高(P<0.05，圖2，表3)。

Fig. 2 Protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, IRS-1, p-IRS-1 and GLUT4 in liver tissue

2.4 各組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表達水平的比較

與對照組相比，NAFLD組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達水平顯著升高，而IRS-1、GLUT4 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動劑組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達水平降低而IRS-1、GLUT4 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05，表4)。

2.5 各組大鼠肝組織及血清細(xì)胞因子IL-1β和IL-18含量的比較

與對照組相比，NAFLD組和GPR81激動劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量均顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量顯著降低(P<0.05，表5)。

3 討論

NAFLD往往與代謝性疾病并存，如肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征等。胰島素抵抗參與NAFLD發(fā)病的理論已被公認(rèn)，它對血糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞合成代謝和器官葡萄糖攝取產(chǎn)生影響[9]。胰島素抵抗可導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生，而脂肪肝又可加重胰島素抵抗[10]。有研究表明，NAFLD模型組小鼠血清空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、ALT和AST均明顯高于對照組，且胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病中起重要作用[11]。本研究用高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠胰島素模型，結(jié)果表明與對照組相比，NAFLD組大鼠血清肝生化指標(biāo)TG、ALT和AST及FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著升高；病理結(jié)果表明NAFLD組大鼠肝細(xì)胞體積增大，排列不規(guī)則，可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞有脂肪滴，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤，提示NAFLD組大鼠在脂肪變性的過程中發(fā)生了胰島素抵抗，NAFLD大鼠模型建立成功。

Tab. 3 The expression levels of NLRP3 signaling pathway related proteins in liver tissues in each group n=3)

Tab. 4 The mRNA expression levels of NLRP3 signaling pathway related genes in liver tissues in each group n=10)

Tab. 5 The contents of IL-1β and IL-18 in liver tissue and serum of rats in each group n=10)

代謝性炎癥在非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，NLRP3的激活促進IL-1β和IL-18的分泌與非酒精性脂肪性肝炎密切相關(guān)，而NLRP3炎癥小體的激活又與高脂飲食脂肪酸的大量攝入有關(guān)[12]。IRS-1是胰島素底物受體，在介導(dǎo)胰島素作用方面起著重要作用。除了通過基因表達調(diào)節(jié)外，IRS-1的活性主要由其磷酸化調(diào)節(jié)[13]。在病理狀態(tài)下，炎癥通路被激活，釋放炎癥因子并通過抑制胰島素通路蛋白表達和信號傳遞影響對葡萄糖的吸收、IRS-1蛋白表達減少，導(dǎo)致胰島素敏感性降低[14]。有研究報道，IRS-1酪氨酸磷酸化使胰島素下游信號通路激活，胰島素發(fā)揮作用；絲氨酸磷酸化抑制胰島素下游信號引起胰島素抵抗；而炎癥細(xì)胞因子、缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過抑制IRS-1和IRS-2絲氨酸的磷酸化直接抑制胰島素作用[15]。GLUT4是一種重要的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，能促進機體對葡萄糖的吸收，GLUT4表達下降可誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗。有研究表明，抑制NLRP3炎癥小體的激活及炎癥因子的產(chǎn)生，降低p-IRS-1的表達，促進IRS-1和GLUT4的表達，從而改善高脂飲食小鼠肝臟和骨骼肌的胰島素抵抗[16]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，NAFLD組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1的表達水平及Ser636-IRS-1的蛋白表達水平均顯著升高，且肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量升高；而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的表達水平顯著降低；結(jié)果提示NAFLD組大鼠肝臟炎性水平顯著升高，NAFLD大鼠發(fā)生胰島素抵抗。

GPR81是乳酸的特異性受體，具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞發(fā)育和分化、抑制脂肪分解、抑制炎性反應(yīng)等生物學(xué)功能[17]。GPR81激動劑能抑制嚙齒動物的空腹血漿游離脂肪酸水平，并降低胰島素抵抗和糖尿病小鼠模型的胰島素敏感性[18]。有研究表明，GPR81激活可以通過降低氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子表達，對動脈粥樣硬化起到保護作用[19]。本研究結(jié)果表明，GPR81激動劑組大鼠血清肝生化指標(biāo)較NAFLD組均顯著降低；光鏡結(jié)果顯示，GPR81激動劑組大鼠肝脂肪變較NAFLD組明顯減輕，脂肪滴及炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；與NAFLD組相比，GPR81激動劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量降低，且肝組織NLRP3信號通路相關(guān)基因表達水平改善；上述結(jié)果提示，GPR81激動劑可抑制細(xì)胞因子的釋放，降低IRS-1的磷酸化水平，促進IRS-1和GLUT4的表達水平，從而改善NAFLD大鼠胰島素抵抗和肝脂肪變，可能與GPR81激動劑抑制NLRP3信號通路有關(guān)。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD中，NLRP3信號通路參與NAFLD胰島素抵抗，GPR81激動劑可抑制NLRP3信號通路的激活，還可以改善炎癥反應(yīng)引起的NAFLD胰島素抵抗，對NAFLD具有保護作用，表明NLRP3信號通路活化介導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生促進了NAFLD的發(fā)生發(fā)展。