郝禮森， 季景秀， 蔣美鈺， 張明婷， 張曉嵐， 展宗媛， 楊小師， 陳盼盼

(1. 華北理工大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 河北 唐山 063000； 2. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院東院消化內(nèi)科， 石家莊 050000)

肝星狀細胞 (hepatic stellate cell, HSC) 是參與肝纖維病理過程中的最重要細胞[1,2]。當肝臟受到損傷時，靜止的HSC活化為肌成纖維細胞，向肝損傷部位遷移，并在肝損傷部位大量增殖，導(dǎo)致肝內(nèi)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生過多而降解減少，引起細胞外基質(zhì)在肝臟過度沉積而導(dǎo)致肝纖維化[1-3]。因此，活化HSC遷移在肝纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用。有研究證實[4, 5]，細胞遷移與細胞骨架的聚合與解聚密切相關(guān)，細胞只有順利完成其骨架的聚合與解聚才能實現(xiàn)遷移。而細胞骨架則是細胞內(nèi)的一種蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由微絲、微管和中間纖維組成。其中，微管是一中空管狀結(jié)構(gòu)，是由α-微管蛋白(α-tubulin)和β-微管蛋白(β-tubulin)組成的異二聚體為基本單位構(gòu)成，其不僅參與維持細胞形態(tài)，還在調(diào)控細胞遷移方面發(fā)揮作用[6]。γ-微管蛋白 (γ-tubulin)則是微管蛋白家族中的另一重要成員，參與微管的起始組裝及促進α-tubulin與β-tubulin聚合[6-8]。第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因 (phosphatase and tensin homology detected on chromosome ten, PTEN)是具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可通過負性調(diào)控細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細胞的增殖、黏附、遷移等細胞生物學行為[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[10, 11]，PTEN表達下調(diào)可顯著增強體外活化HSC的遷移能力，并顯著增強體外活化肝星狀細胞骨架的重構(gòu)及構(gòu)成微絲的重要骨架蛋白—纖維狀肌動蛋白(filamentous actin, F-actin)的形成。但有關(guān)PTEN表達下調(diào)對體外活化肝星狀細胞α-tubulin及γ-tubulin的影響，目前仍不清楚。因此，本研究以大鼠肝星狀細胞系HSC-T6為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HSC-T6細胞的PTEN表達，探討PTEN表達下調(diào)對體外活化肝星狀細胞α-tubulin及γ-tubulin表達的影響，為深化對肝纖維化病理生理機制的認識提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院；表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP及攜帶靶向PTEN的RNA干擾序列—短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)并表達GFP的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN由武漢浙瑪生物技術(shù)公司協(xié)助構(gòu)建，通過反復(fù)感染AD293細胞獲得實驗所需的腺病毒；兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyseral-dehyde- 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體及小鼠抗PTEN單克隆抗體購于英國Abcam公司；兔抗α-tubulin單克隆抗體及小鼠抗γ-tubulin多克隆抗體購于美國Affinity公司；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG均購于美國KPL公司。

1.2 腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化肝星狀細胞

以5×104cells/ml密度在培養(yǎng)器皿中接種活化大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，加入含10%胎牛血清的DMEM于5% CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)，當細胞生長至80%-%90%密度時，以感染倍數(shù)100進行腺病毒轉(zhuǎn)染。腺病毒轉(zhuǎn)染前先確定感染所需的病毒量(所需病毒量=細胞數(shù)×感染倍數(shù))，然后去除細胞培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基并用無血清無抗生素的DMEM清洗細胞，將無血清無抗生素DMEM稀釋的腺病毒液加入培養(yǎng)器皿中，于5% CO2、37℃的孵育箱中孵育2 h后補充完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 實驗分組

(1)對照組(Control組)：以DMEM代替腺病毒液進行腺病毒轉(zhuǎn)染；(2)Ad-GFP組：以對照空病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染體外活化HSC；(3)Ad-shRNA/PTEN組：以攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN轉(zhuǎn)染體外活化HSC。上述HSC在腺病毒轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察其熒光表達，并通過計數(shù)表達熒光的HSC計算腺病毒轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后熒光表達陽性的HSC數(shù)達80%以上，72 h與48 h比較無明顯增強，且細胞出現(xiàn)廣泛病變并有明顯脫落，本實驗相關(guān)檢測均采用腺病毒轉(zhuǎn)染48 h的活化肝星狀細胞。

1.4 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測體外活化HSC的PTEN mRNA表達

由上海生工生物公司協(xié)助設(shè)計合成目的基因PTEN及內(nèi)參照基因GAPDH引物(PTEN：上游引物為5’-TCC TGC AGA AAG ACT TGA AGG T-3’，下游引物為5’-GCT GTG GTG GGT TAT GGT CT-3’，擴增產(chǎn)物為182 bp；GAPDH：上游引物為5’-GGC TCA TGA CCA CAG TCC AT-3’，下游引物為5’-ACA TTG GGG GTA GGA ACA CG-3’，擴增產(chǎn)物為202 bp)后，應(yīng)用TRizol試劑盒并按操作說明提取3組HSC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后在Master cycler ep Real Plex4 實時熒光定量PCR儀上進行實時定量擴增，采用相對定量2-△△Ct法比較3組HSC的PTEN mRNA表達差異[12]。

1.5 Western blot技術(shù)檢測體外活化HSC的PTEN蛋白表達

應(yīng)用細胞裂解液裂解上述各組HSC，然后提取細胞蛋白并測定蛋白含量，SDS-PAGE電泳后在含5%的BSA的TBST中封閉2 h，加入兔抗GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗PTEN單克隆抗體 (1∶100)，4℃過夜后置于搖床上，TBST振搖洗膜，共4次，每次10 min；分別加入 HRP標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG (1∶5 000) 于室溫下孵育2 h，置于搖床上TBST振搖洗膜，共4次，每次10 min；加入ECL顯色液，用生物分子顯像儀進行免疫顯色。采用Image JV1.47軟件對Western blot結(jié)果進行定量分析，結(jié)果用PTEN蛋白與GAPDH蛋白的積分光密度值(integral optical density, IOD)的比值表示。

1.6 免疫熒光技術(shù)檢測體外活化肝星狀細胞的α-tubulin及γ-tubulin表達

共聚焦小皿內(nèi)以5×104cells/ml密度接種HSC-T6細胞，按照上述分組及腺病毒轉(zhuǎn)染方法進行腺病毒轉(zhuǎn)染并置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后棄除培養(yǎng)基并用PBS輕洗5 min，在室溫下用4%多聚甲醛固定細胞30 min，然后吸去4%多聚甲醛室溫條件下用PBS輕洗3次，每次5 min；用0.1% Triton-X 室溫下透膜處理5 min，洗凈透膜液并用PBS輕洗3次，每次5 min；吸干PBS后用濾紙輕拭小皿上多余液體，并用2%山羊血清約150 μl封閉30 min；吸凈封閉液，分別將1∶300稀釋的兔抗α-tubulin單克隆抗體及1∶200稀釋的小鼠抗γ-tubulin多克隆抗體加入上述共聚焦小皿內(nèi)，于4℃孵育過夜，并于次日吸凈上述一抗稀釋液后用PBS輕洗3次，每次5 min；于一抗為兔抗α-tubulin單克隆抗體的共聚焦小皿內(nèi)滴加TRITC標記的山羊抗兔IgG熒光二抗，于一抗為小鼠抗γ- tubulin多克隆抗體的共聚焦小皿內(nèi)滴加TRITC標記的山羊抗小鼠IgG熒光二抗，于室溫下孵育1 h(避光)；棄去二抗稀釋液后用PBS輕洗3次，每次5 min，然后用0.1%DAPI復(fù)染細胞核5 min，再用PBS輕洗后滴加防熒光淬滅甘油，并立即在激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，隨機選取6個視野，應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件分析熒光圖像，分別計算α-tubulin、γ-tubulin熒光表達IOD，以IOD作為其蛋白的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 體外活化肝星狀細胞的PTEN低表達模型構(gòu)建

實時熒光定量PCR檢測3組HSC的PTEN mRNA表達，Ad-shRNA/PTEN組及Ad-GFP組HSC的PTEN mRNA表達量相對于對照組分別為0.64倍、0.92倍(對照組HSC的PTEN mRNA表達量被定為1)。結(jié)果顯示與對照組及Ad-GFP組比較，Ad-shRNA/PTEN組HSC的PTEN mRNA表達量明顯降低 (P<0.05)，而Ad-GFP組HSC的PTEN mRNA表達量與對照組比較無顯著差異 (P>0.05，表1)。Western blot檢測3組HSC的PTEN蛋白表達顯示，與對照組(1.438±0.038)及Ad-GFP組(1.413±0.058)比較，Ad-shRNA/PTEN組HSC的PTEN蛋白表達量(1.088±0.036)明顯降低(P<0.05)；而Ad-GFP組與對照組HSC的PTEN蛋白表達量無顯著差異 (P>0.05，圖1)。上述結(jié)果表明靶向PTEN的shRNA成功轉(zhuǎn)染體外活化肝星狀細胞并下調(diào)HSC的PTEN表達，體外活化HSC的PTEN低表達模型成功構(gòu)建。

Tab. 1 PTEN mRNA expression of HSC in three groups n=6)

Fig. 1 PTEN protein expression of HSC in three groups was detected by Western blot n=6)

2.2 下調(diào)PTEN表達對體外活化肝星狀細胞α-tubulin及γ-tubulin表達的影響

在激光掃描共聚焦顯微鏡下分別觀察應(yīng)用兔抗α-tubulin單克隆抗體及小鼠抗γ-tubulin多克隆抗體進行熒光染色的HSC， 其α-tubulin及γ-tubulin均顯示紅色熒光，主要表達于細胞漿。對照組和Ad-GFP組HSC的α-tubulin呈絲網(wǎng)狀、輻射狀均勻分布于細胞核周圍，而Ad-shRNA/PTEN 組HSC的α-tubulin分布發(fā)生變化，表現(xiàn)為向細胞兩端末梢逐漸聚集并在細胞兩端稍增多；與對照組及Ad-GFP組比較，Ad-shRNA/PTEN組HSC的α-tubulin熒光IOD明顯升高(P< 0.05)，而Ad-GFP組與對照組HSC的 α-tubulin熒光IOD相比較，無顯著差異(P>0.05，圖2，表2)。3組HSC的γ-tubulin均在胞漿中有散在點狀聚集，但Ad-shRNA/PTEN組HSC的γ-tubulin點狀聚集更明顯；與對照組及Ad-GFP組比較，Ad-shRNA/PTEN組HSC的γ-tubulin熒光IOD明顯升高(P< 0.05)，而Ad-GFP組與對照組HSC的γ-tubulin熒光IOD比較無顯著差異(P>0.05，圖3，表2)

Fig. 2 The α-tubulin expressions of HSC in three groups were observed under laser scanning confocal microscope (×600)

Tab. 2 The comparison of α-tubulin and γ-tubulin fluorescence IOD of HSC in three groups n=6)

Fig. 3 The γ-tubulin expressions of HSC in three groups were observed under laser scanning confocal microscope (×600)

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種損傷的自我修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病演變?yōu)楦斡不牟±磉^程，而HSC則是參與此過程的最重要細胞[1, 2, 13 ]。研究顯示[1, 2]，在肝纖維化病理過程中，不僅HSC活化是啟動該病理過程的開端，且活化HSC向肝損傷部位遷移也發(fā)揮重要作用。而細胞遷移則是細胞接收到遷移的信號后，通過細胞前沿的反復(fù)伸展，細胞基部的反復(fù)收縮，以及細胞與細胞間質(zhì)的粘附及解粘附，向遷移信號源方向移動的一系列動態(tài)循環(huán)過程。在上述過程中，細胞骨架聚合與解聚的動態(tài)循環(huán)發(fā)揮著“執(zhí)行者”的作用，若其動態(tài)性重構(gòu)受阻，尤其是微絲和微管的形成及重構(gòu)受阻，則細胞遷移過程將受到抑制[14, 15]。因此，細胞遷移不僅受細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)空還與細胞骨架的聚合與解聚密切相關(guān)。

PTEN是具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其表達可通過負性調(diào)控黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細胞的遷移[16]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 表達下調(diào)不僅可通過增強FAK信號活性，促進體外活化HSC遷移，并且可顯著增強體外活化HSC的微絲肌動蛋白F-actin的重構(gòu)[10, 11]。這表明PTEN表達異常不僅與腫瘤細胞的遷移有關(guān)，也可通過影響微絲肌動蛋白F-actin的重構(gòu)參與對活化HSC遷移的調(diào)控。但關(guān)于PTEN表達下調(diào)對體外活化肝星狀細胞α-tubulin表達的影響，目前仍不清楚。為探討PTEN低表達對體外活化肝星狀細胞α-tubulin表達的影響，本研究在應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)體外活化HSC的PTEN表達后，采用免疫熒光法檢測了活化HSC的α-tubulin表達變化。實驗結(jié)果顯示，下調(diào)體外活化HSC的PTEN表達引起HSC的α-tubulin表達顯著升高，并使HSC內(nèi)α-tubulin的分布發(fā)生變化，表現(xiàn)為向細胞兩端末梢逐漸聚集、在細胞兩端稍增多。如前所述α-tubulin和β-tubulin組成的異二聚體是微管的基本組成單位，HSC的α-tubulin胞內(nèi)分布發(fā)生變化即提示其微管排列發(fā)生紊亂。結(jié)合本課題組前期研究顯示大鼠纖維化肝組織及在體HSC的PTEN表達下調(diào)[17]，PTEN表達下調(diào)可促進體外活化HSC的遷移[10]。本研究結(jié)果提示，PTEN表達下調(diào)可能通過引起活化HSC的α-tubulin表達上調(diào)及微管排列紊亂，進而促進活化肝星狀細胞遷移而參與肝纖維化。

γ-tubulin是微管蛋白家族中的另一重要成員，位于細胞的中心體，功能上除了有助于α-tubulin與β-tubulin聚合，參與微管的起始組裝外，還是有絲分裂中心體復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，能控制有絲分裂紡錘體的復(fù)制[6-8]。本課題組在檢測PTEN表達下調(diào)對體外活化肝星狀細胞α-tubulin表達影響的同時，也檢測了PTEN表達下調(diào)對體外活化肝星狀細胞γ-tubulin表達的影響，結(jié)果顯示，PTEN表達下調(diào)使體外活化HSC的γ-tubulin表達明顯上調(diào)。γ-tubulin的功能與微管組裝有關(guān)，可幫助α-tubulin和β-tubulin聚合，結(jié)合本課題組的前期研究顯示體外活化HSC的PTEN表達下調(diào)可促進其遷移[10]。本研究結(jié)果提示，下調(diào)活化HSC 的PTEN表達可能通過增強肝星狀細胞的γ-tubulin表達，進而促進其微管組裝，加快其遷移而參與肝纖維化。另外，γ-tubulin為有絲分裂中心體復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，通過參與有絲分裂紡錘體的復(fù)制而參與細胞增殖，其表達上調(diào)亦可能通過促進活化HSC的增殖參與肝纖維化。

綜上所述，本研究表明下調(diào)PTEN表達可顯著升高體外活化HSC的α-tubulin及γ-tubulin表達并使其胞內(nèi)分布發(fā)生改變，提示PTEN表達下調(diào)引起的體外活化HSC上述微管蛋白變化可能通過促進活化HSC的遷移參與肝纖維化病理過程，這一實驗結(jié)果為深化對肝纖維化的病理生理機制的理解提供了實驗依據(jù)。