牛衍龍， 曹建民， 周綺云， 胡 戈， 郭 嫻， 劉 健， 郝 敏， 張 濤， 周海濤△

(1. 贛南醫(yī)學(xué)院， 江西 贛州 341000； 2. 贛州市康復(fù)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 贛州 341000； 3. 北京體育大學(xué)， 北京 100084； 4. 北京聯(lián)合大學(xué)， 北京 100101； 5. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191； 6. 常州大學(xué)， 江蘇 常州 213164)

腎臟是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要器官，其受衰老影響最為突出[1]。氧化應(yīng)激不僅是腎臟誘發(fā)衰老的重要危險(xiǎn)因素，也是慢性腎臟疾病發(fā)生的生理/病理基礎(chǔ)[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)作為細(xì)胞拮抗氧化應(yīng)激的調(diào)控因子，可通過(guò)調(diào)控下游多種Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶表達(dá)，緩解和改善老年大鼠腎臟氧化應(yīng)激，延緩腎臟衰老[3]。研究表明，營(yíng)養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)的聯(lián)合干預(yù)具有潛在協(xié)同作用，可以提高大鼠機(jī)體抗氧化酶的活性，拮抗氧化應(yīng)激[4]。蝦青素作為天然抗氧化劑能夠顯著提高野生型線蟲(chóng)在氧化應(yīng)激條件下平均和最大生存時(shí)間[5]。同時(shí)，蝦青素可以通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路緩解氧化應(yīng)激，改善病理性腎損傷[6]。有氧運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)調(diào)控自身機(jī)能、Nrf2信號(hào)通路，拮抗衰老過(guò)程中機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[7]。蝦青素可以通過(guò)促進(jìn)有氧運(yùn)動(dòng)提升機(jī)體機(jī)能和抗氧化能力，改善大鼠腦組織因氧化應(yīng)激損傷引發(fā)的功能性退化，二者具有協(xié)同作用[8]，但其復(fù)合干預(yù)在腎臟衰老中的作用及其機(jī)制鮮有報(bào)道。綜上，本實(shí)驗(yàn)探討蝦青素復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖誘發(fā)大鼠腎臟衰老的干預(yù)作用及其機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠(3月齡，380～410 g)，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)合格證編號(hào)SCXK(京)2019-0010)。北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度20～24℃，相對(duì)濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。4 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，采用兩因素兩水平2×2析因設(shè)計(jì)將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C組)、急性衰老組(S組)、蝦青素+急性衰老組(AS組)、有氧運(yùn)動(dòng)+急性衰老組(ES組)、蝦青素+有氧運(yùn)動(dòng)+急性衰老組(AES組)，每組12只。

1.2 急性衰老動(dòng)物模型建立

S、AS、ES、AES組腹腔注射100 mg/(kg·d) D-半乳糖，為期6周，建立經(jīng)典急性腎衰老動(dòng)物模型[9]，C組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 運(yùn)動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)

6周急性衰老動(dòng)物模型建立期間，ES、AES組進(jìn)行強(qiáng)度為60%最大攝氧量的有氧運(yùn)動(dòng)(15 m/min速度，坡度0°，60 min/d)，其他組無(wú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

蝦青素(純度2%，北京綠色金可生物技術(shù)股份有限公司饋贈(zèng))以蒸餾水稀釋?zhuān)?℃存放備用。根據(jù)文獻(xiàn)[10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AS、AES組大鼠蝦青素劑量為1 g/(kg·d)(純品劑量20 mg/(kg·d))，灌胃體積為5 ml/kg；其他組灌胃等體積蒸餾水。訓(xùn)練期間，每天采用專(zhuān)業(yè)灌胃器灌胃1次。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

末次訓(xùn)練結(jié)束后12 h，戊巴比妥鈉麻醉大鼠后從腹主動(dòng)脈取血，室溫自然凝固，待血清出現(xiàn)后4℃離心10 min，3 000 r/min，分離血清，-20℃凍存待測(cè)。迅速取出雙腎，稱(chēng)重后剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污；左側(cè)腎臟取約1 mm×1 mm×1 mm腎皮質(zhì)，迅速放置于2.5%戊二醛固定液，常溫固定4 h后4℃保存；剩余左側(cè)腎臟浸入4%多聚甲醛，固定24 h后包埋；右側(cè)組織切塊錫紙包裹投入液氮，取材結(jié)束后移至-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 檢測(cè)儀器

HT7700透射電子顯微鏡(日本日立公司)，Leica UC7超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，BX51F32H01光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)，Allegra 25R臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)雷博公司)，RF-6000熒光分光光度儀(日本島津公司)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 腎臟病理變化評(píng)價(jià) 取出多聚甲醛固定液中的腎臟組織，經(jīng)流水沖洗和梯度乙醇(70%、80%、90%、95%、100% I、100% II)脫水，二甲苯透明后石蠟滲透，包埋，橫斷面切片(厚度為4 μm)烘干，進(jìn)行HE染色，分別在100倍和400倍光鏡下，觀察腎臟組織病理變化。

1.6.2 腎臟超微結(jié)構(gòu)變化評(píng)價(jià) 取出戊二醛固定液中腎臟組織，1×PBS洗3次，蒸餾水洗3次，用1%鋨酸固定1 h后蒸餾水洗3次，2%鈾染1 h，蒸餾水洗后(鋁箔中脫水)分別浸入梯度丙酮(30%、50%、70%、90%、100%)，滲透過(guò)程為樹(shù)脂：丙酮1∶3混合液1 h，樹(shù)脂：丙酮1∶1混合液2 h，樹(shù)脂：丙酮2∶1混合液過(guò)夜，經(jīng)過(guò)3次樹(shù)脂滲透后過(guò)夜，次日60℃烘箱高溫聚合，精修組織塊，切片機(jī)制成1 μm切片后用6 000倍透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)。

1.6.3 腎臟相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)Nrf-2、磷酸化核因子E2相關(guān)因子2(phosphory lated nuclear factor erythroid 2-related factor 2, p-Nrf2)和血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)表達(dá)情況。石蠟切片脫蠟至水經(jīng)抗原修復(fù)后，加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進(jìn)行血清封閉，隨后加入一抗、二抗，進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片?？贵w分別由Abcam公司和武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.6.4 H-score評(píng)分方法 H-score評(píng)分是準(zhǔn)確定量處理免疫組化結(jié)果的一種組織學(xué)評(píng)分方法，即采用病理切片掃描儀將每張切片進(jìn)行全視野數(shù)字掃描，將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)數(shù)值，應(yīng)用公式計(jì)算H-score[11]。根據(jù)細(xì)胞核顏色，將每個(gè)組織點(diǎn)的染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為像素面積并計(jì)算陽(yáng)性百分比，深棕色、棕黃色、淺黃色和藍(lán)色依次判定為強(qiáng)陽(yáng)性、中度陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性。H-score=(弱陽(yáng)性細(xì)胞密度×1)+(中陽(yáng)性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞密度×3)，計(jì)算后進(jìn)行組間評(píng)定。

1.6.5 其他指標(biāo)測(cè)試方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腎臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和γ-谷氨酸半胱氨酸合酶(γ glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，熒光比色法測(cè)定脂褐質(zhì)(lipofuscin，LPF)含量。以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠腎臟組織形態(tài)的比較

100倍及400倍光鏡下觀察顯示(圖1、圖2)，C組大鼠腎小球分布密集，結(jié)構(gòu)完整清晰，多呈圓形或橢圓形，腎小囊囊腔及腎小管管腔大多規(guī)整且狹小。與C組比較，S組腎小球數(shù)量明顯減少，分布稀疏，球體縮小且外周不規(guī)則；腎小囊囊腔及腎小管管腔擴(kuò)張明顯。與S組比較，AS組腎小球明顯增多，且分布較為密集，形態(tài)趨于正常，腎小管形態(tài)基本正常，但仍存在腎小囊囊腔增大現(xiàn)象；ES組大鼠腎小球明顯增多，且分布較為密集，形態(tài)趨于正常，腎小囊形態(tài)基本正常，但腎小管管腔擴(kuò)張未得到完全改善。與AS、ES組比較，AES組腎臟組織形態(tài)趨于正常，僅個(gè)別腎小管管腔存在擴(kuò)張現(xiàn)象。

Fig. 1 Pathological changes in renal tissues of rats in each group (HE ×100)

Fig. 2 Pathological changes in renal tissues of rats in each group (HE ×400)

2.2 五組大鼠腎臟組織的比較

6 000倍電鏡觀察顯示(圖3)，C組大鼠濾過(guò)屏障視野下結(jié)構(gòu)完整，基底膜厚度均勻，足細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體大多數(shù)無(wú)明顯或輕微擴(kuò)張，足突未見(jiàn)明顯融合，裂孔隔膜均勻，未見(jiàn)明顯增寬或變窄。與C組比較，S組基底膜厚度不均，存在局部明顯增厚，足突較稀疏，足細(xì)胞細(xì)胞器較少，細(xì)胞核不規(guī)則，線粒體輕度腫脹，部分膜破損，嵴減少、斷裂，個(gè)別局部空泡化，足突融合，裂孔隔膜不勻，部分增寬或變。與S組比較，AS組損傷程度較低，基底膜厚度較均勻，未見(jiàn)明顯局部增厚區(qū)，足細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度或中度腫脹，中度腫脹者局部空泡化、嵴消失，足突未見(jiàn)明顯融合，裂孔隔膜整體較均勻；ES組結(jié)果基本同于AS組，損傷程度較低。與AS、ES組比較，AES組濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)較完整，損傷程度低，基底膜厚度較均勻，足細(xì)胞未見(jiàn)明顯水腫，線粒體大部分無(wú)明顯腫脹，嵴少量斷裂，個(gè)別局部空泡化，足突未見(jiàn)明顯融合，裂孔隔膜整體較均勻、略窄。

Fig. 3 Renal ultrastructure of rats(TEM ×6 000)

2.3 五組大鼠腎臟組織衰老指征標(biāo)志物水平的比較

腎臟組織SOD活性，與C組比較，S組顯著降低(P<0.05)；與S組比較，AS組、ES組、AES組均顯著升高(P<0.01)；與AS組、ES組比較，AES組均顯著升高(P<0.01)。γ-GCS活性，與C組比較，S組顯著降低(P<0.01)；與S組比較，AS組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，ES組、AES組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與AS組比較，AES組顯著升高(P< 0.05)，而ES組、AES組組間無(wú)顯著性差異(P> 0.05)。MDA含量，與C組比較，S組顯著升高(P< 0.05)；與S組比較，AS組、ES組、AES組均顯著降低(P<0.01)；與AS、ES組比較，AES組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。LPF含量，與C組比較，S組顯著升高(P<0.01)；與S組比較，AS組、ES組、AES組均顯著降低(P<0.01)；與AS組、ES組比較，AES組均顯著升高(P<0.01，表1)。腎臟SOD活性和LPF含量?jī)梢蛩鼐哂袇f(xié)同作用，而γ-GCS活性和MDA含量?jī)梢蛩貐f(xié)同作用不明顯。

2.4 五組大鼠腎臟組織Nrf-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

腎臟組織Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平：與C組比較，S組顯著降低(P<0.01)；與S組相比，AS組、ES組、AES組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與AS組、ES組比較，AES組均顯著升高(P<0.05或P< 0.01)。p-Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，與C組比較，S組顯著降低(P<0.01)；與S組比較，AS組、ES組、AES組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與AS組、ES組比較，AES組均顯著升高(P<0.01)。HO-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平：與C組比較，S組顯著降低(P<0.01)；與S組比較，AS組、ES組、AES組均顯著升高(P<0.01)；與AS組相比，AES組無(wú)顯著差異(P> 0.05)，而與ES組比較，AES組顯著升高(P<0.05，表2，圖4)。腎臟Nrf2和p-Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，兩因素具有協(xié)同作用，而對(duì)于HO-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平，兩因素協(xié)同作用不明顯。

Tab. 1 SOD/γ-GCS activities and MDA/LPF concentrations in renal tissues of rats in each group n=12)

Tab. 2 H-scores of Nrf2/p-Nrf2 and HO-1 in renal tissues of rats in each group n=12)

Fig. 4 The expressions of Nrf2 and HO-1 in renal tissues in each group

3 討論

D-半乳糖過(guò)量攝入后在體內(nèi)被還原成半乳糖醇，或?qū)е陆M織細(xì)胞滲透應(yīng)激和線粒體功能障礙，或被氧化成H2O2降低SOD水平，或與胺形成希夫堿化合物和糖基化終產(chǎn)物增加機(jī)體氧化酶含量。D-半乳糖致亞急性大鼠衰老模型無(wú)論從臟器組織形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激相關(guān)因素等變化均與自然衰老相似，已成為公認(rèn)的經(jīng)典衰老模型[12]。

腎臟對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，在人體衰老過(guò)程中，腎臟功能減退，是最快的損傷器官之一[13]。LDF是衰老重要表征，與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA、谷胱甘肽(glutathiose，GSH)、SOD同樣是公認(rèn)的衰老標(biāo)志物[14]，γ-GCS作為GSH合成的催化酶和限速酶，其活性降低與GSH水平下降密切相關(guān)[15]。機(jī)體內(nèi)Nrf2信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)控體內(nèi)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶，清除過(guò)量的自由基，拮抗氧化應(yīng)激[16]。

蝦青素是海洋生物中含量最為豐富的類(lèi)胡蘿卜素，具有強(qiáng)抗氧化活性。研究表明，蝦青素可通過(guò)磷酸化修飾Nrf2蛋白上第40位絲氨酸，致其與Keap1解離，使抗氧化元件ARE及其保護(hù)性蛋白的合成過(guò)程被激活，改善組織器官氧化應(yīng)激損傷[17]；蝦青素分子結(jié)構(gòu)末端的不飽和醛基和羥基為活性氧和自由基提供電子，有效清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的自由基[18]。運(yùn)動(dòng)作為一種可行的、非藥物療法可逆轉(zhuǎn)衰老進(jìn)程中組織線粒體功能受損[19]，并通過(guò)激活生物體自身調(diào)節(jié)機(jī)能，提高機(jī)體抗氧化能力，緩解衰老所致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕組織器官功能退化[20]。據(jù)李丹等[21]報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)能夠激活糖尿病大鼠心肌組織Nrf2信號(hào)通路，增加下游抗氧化酶表達(dá)，抵抗心肌氧化應(yīng)激損傷。相關(guān)研究已證實(shí)運(yùn)動(dòng)與Nrf2激動(dòng)劑聯(lián)合具有正向協(xié)同作用，可以有效增強(qiáng)機(jī)體組織器官的抗氧化能力[4]。Yook等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以協(xié)同改善動(dòng)物體機(jī)能和抗氧化能力，蝦青素促進(jìn)有氧運(yùn)動(dòng)改善異常組織結(jié)構(gòu)與機(jī)能。本研究中，與C組比較，S組大鼠腎臟衰老標(biāo)志物：SOD、γ-GCS活性顯著降低，LPF、MDA含量顯著升高的同時(shí)，腎組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，與自然衰老大鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢(shì)相一致[11]。與S組比較，AS組、ES組、AES組腎臟Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白質(zhì)表達(dá)及SOD活性顯著升高，LPF、MDA含量顯著降低的同時(shí)，腎組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均有所改善，提示蝦青素、有氧運(yùn)動(dòng)均可通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)緩解和改善氧化應(yīng)激，延緩腎臟衰老。與AS與ES組比較，AES組大鼠改善更為明顯，且部分指標(biāo)存在正向協(xié)同作用，提示蝦青素和有氧運(yùn)動(dòng)復(fù)合干預(yù)效果較單一干預(yù)更為有效。綜上，蝦青素、有氧運(yùn)動(dòng)均可激活衰老大鼠腎臟內(nèi)Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)拮抗氧化應(yīng)激能力；而兩者復(fù)合干預(yù)效果更佳，其機(jī)制可能為蝦青素可以促進(jìn)有氧運(yùn)動(dòng)修復(fù)衰老所致腎臟線粒體功能障礙，進(jìn)一步提升抗氧化能力，延緩衰老。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)復(fù)合營(yíng)養(yǎng)干預(yù)可有效地延緩腎臟衰老的發(fā)生與發(fā)展，為蝦青素的深度開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。