齊玉紅， 孫 思， 王 玲， 楊 靜， 吳光英， 黃 琪， 胥文春△

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室, 重慶 400016; 2. 重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗科， 重慶 401147)

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，由多種細胞(中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等)和細胞組分參與，主要癥狀為呼吸困難、咳嗽、喘息等。激素是其常規(guī)治療藥物，然而長期使用易引發(fā)耐受及嚴重副作用，進一步闡明哮喘的發(fā)病機制可為新治療策略的研究奠定基礎(chǔ)[1]。

顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)是一種多功能分泌性生長因子，參與機體組織損傷修復(fù)、炎癥、腫瘤發(fā)生等病理生理過程[2]。有報道顯示哮喘患者血清PGRN水平顯著低于健康人[3]，在甲苯二異氰酸酯暴露所致的職業(yè)性哮喘患者血清中PGRN水平也明顯低于正常對照組[4]，而重組PGRN滴鼻處理能夠減輕過敏性哮喘小鼠氣道高反應(yīng)[1]，這些研究表明PGRN可能參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，然而其機制并不清楚。IL-6作為重要的促炎因子，可誘導(dǎo)初始T細胞向Th17細胞極化，而Th17又與中性粒細胞募集相關(guān)，中性粒細胞增多可加重哮喘氣道炎癥[5]。與正常對照組相比，過敏性哮喘患者疾病發(fā)作期外周血IL-6水平明顯升高[6]，且有報道稱PGRN的特異性沉默可促進IL-6的產(chǎn)生[7,8]，因此我們推測PGRN在哮喘中發(fā)揮作用可能與IL-6有關(guān)。本課題旨在通過構(gòu)建體內(nèi)外哮喘模型，研究PGRN是否通過影響IL-6的表達而在哮喘中發(fā)揮作用以及其中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6-8周的C57BL/6雌性小鼠購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，IL-6 ko小鼠購于Jackson實驗室，以上小鼠均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗動物許可證號：SCKK(渝)2012-0001。所有動物實驗操作均嚴格遵守學(xué)校實驗動物倫理委員會管理規(guī)定。

1.2 主要試劑

雞卵清蛋白OVA、鋁佐劑和戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich，USA)；細胞因子IL-5、IL-6和IgE ELISA檢測試劑盒(Biolegend，USA)；小鼠及人PGRN ELISA試劑盒(R&D，USA)；RNAiso plus及cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Japan)；RIPA和BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；人IL-13(PeproTech, USA)；重組人PGRN(R&D，USA)；兔抗鼠p-p38抗體(美國CST公司)。

1.3 構(gòu)建小鼠哮喘模型

分別在野生鼠和IL-6 缺陷鼠(6～8周的雌性C57BL/6小鼠)中設(shè)置對照組和哮喘模型組，每組8只。模型組中，在第0日和第7日致敏小鼠(腹腔注射OVA 100 μg)，從第14日起連續(xù)激發(fā)8 d(5%OVA霧化吸入，30 min/d，每日1次)，末次激發(fā)24 h后取標本(圖1)；對照組用PBS代替OVA做相同處理。采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行白細胞計數(shù)和分類計數(shù)；HE染色觀察肺組織病理情況；Q-PCR及ELISA檢測小鼠肺勻漿、血清和BALF中細胞因子水平。

Fig. 1 Method for constructing mice model of asthma

1.4 體外哮喘炎癥模型的構(gòu)建及細胞的處理

用IL-13刺激人肺泡上皮細胞A549或支氣管上皮細胞BEAS-2B建立體外哮喘炎癥模型，每組3個復(fù)孔，共4組：PBS處理組、IL-13處理組、IL-13與重組人PGRN蛋白(rhPGRN)共同處理組及p38磷酸化抑制劑(SB203508)處理組。具體處理方法如下：PBS組僅加入無抗生素培養(yǎng)基2 ml/well；IL-13處理組加入含IL-13(200 ng)的無抗生素培養(yǎng)基2 ml/well；IL-13與rhPGRN共同處理組加入含IL-13(200 ng)和rhPGRN(500 ng)的無抗生素培養(yǎng)基2 ml/well；P38磷酸化抑制劑(SB203508)處理組加入SB203508預(yù)處理1 h后，再加入含IL-13(200 ng)和rhPGRN(500 ng)的無抗生素培養(yǎng)基2 ml/well；處理0 min～48 h后收集細胞及上清，用Q-PCR及ELISA檢測PGRN和IL-6的表達；Western blot檢測p38的磷酸化。

1.5 Q-PCR檢測

使用RNAiso Plus從肺組織中提取RNA，然后使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)其說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒對cDNA進行Q-PCR分析，以GAPDH作為內(nèi)參。本研究中用于Q-PCR的引物序列見表1。

1.6 ELISA檢測

用ELISA檢測IL-5、IL-6、IgE和PGRN的蛋白水平，其具體操作參考試劑盒說明書。

1.7 Western blot

RIPA法提取細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣，電泳；轉(zhuǎn)膜；5%奶粉室溫封閉1.5 h；兔抗鼠p-p38抗體、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，并于室溫孵育HRP標記的羊抗兔IgG抗體1 h；TBST洗膜3次后，于干化學(xué)發(fā)光顯影儀上進行發(fā)光顯影。

Tab. 1 The sequences of PCR primers

1.8 肺組織切片染色

于OVA末次激發(fā)后24 h獲取小鼠肺組織，并固定在4%的多聚甲醛溶液中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，最后進行蘇木精-伊紅(HE)染色或糖原(PAS)染色。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)哮喘模型中PGRN和IL-6的表達

文獻報道哮喘患者血清PGRN水平明顯低于健康人[3]。為研究小鼠哮喘模型中PGRN的變化情況，我們構(gòu)建了混合型哮喘模型(中性粒細胞和嗜酸性粒細胞都升高)。與對照組小鼠相比，哮喘組小鼠肺組織損傷更嚴重，炎癥細胞浸潤增加，PAS染色顯示粘液分泌增多(圖2)；BALF中細胞總數(shù)升高(P<0.01，表2)，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞均顯著升高(P<0.01, 表2)；BALF及血清中IL-5及IgE均顯著升高(P<0.01，表3)。這些結(jié)果表明小鼠哮喘模型構(gòu)建成功。

與對照組小鼠相比，模型組小鼠肺組織PGRN的mRNA表達水平顯著降低(P<0.01, 表4)，BALF中PGRN蛋白顯著降低(P<0.01，表4)，血清PGRN蛋白有降低的趨勢(表4)，這與文獻報道的哮喘患者體內(nèi)PGRN表達降低基本一致。我們同時檢測了IL-6的表達，結(jié)果顯示，模型組小鼠BALF中IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05，表4)。

Fig. 2 Photomicrographs of HE and PAS-stained lung tissue sections of mice

Tab. 2 Total inflammatory cells and the differential cell counts in BALF of mice (×104, n=8)

Tab. 3 Levels of IgE and IL-5 in serum and BALF of mice n=8)

Tab. 4 The expressions of PGRN and IL-6 in mice n=8)

2.2 體外哮喘炎癥模型中PGRN和IL-6的表達

為了解體外哮喘模型中PGRN和IL-6的表達情況，我們用IL-13(100 ng/ml)處理人肺泡上皮細胞A549或支氣管上皮細胞BEAS-2B構(gòu)建體外哮喘炎癥模型[9]。結(jié)果顯示，與PBS組相比，IL-13處理人肺泡上皮細胞A549 6 h后PGRN mRNA水平顯著降低(P<0.05，表5)；48 h后PGRN蛋白水平也顯著降低(P<0.05，表5)。用IL-13處理BEAS-2B后得到相似的結(jié)果(表5)。與PBS組相比，用IL-13處理A549 6 h后IL-6 mRNA表達升高(P<0.05，表5)；IL-6蛋白水平也在刺激48 h后升高(P<0.01，表5)。這些結(jié)果表明PGRN和IL-6的表達在體內(nèi)外模型中是一致的。

Tab. 5 Levels of PGRN and IL-6 in vitro inflammation model n=3)

2.3 體外哮喘炎癥模型中rhPGRN對IL-6的調(diào)節(jié)

體外培養(yǎng)人肺泡上皮細胞A549，分別采用PBS處理、IL-13(100 ng/ml)單獨處理、IL-13(100 ng/ml)+rhPGRN(250 ng/ml)共同處理，比較IL-6的變化情況。結(jié)果顯示，IL-13處理組的IL-6mRNA及蛋白水平均較PBS組增加(P<0.01，表6)；而較單獨IL-13處理組，IL-13+rhPGRN共同處理組中IL-6 mRNA及蛋白水平均顯著降低(P分別為P<0.01及P<0.05，表6)，提示在體外哮喘炎癥模型中rhPGRN能降低促炎因子IL-6的表達。

Tab. 6 rhPGRN inhibited the production of IL-6 in vitro inflammation model n=3)

2.4 體外哮喘炎癥模型中rhPGRN抑制IL-6產(chǎn)生的機制

MAPK信號通路對于IL-13刺激上皮細胞產(chǎn)生促炎因子至關(guān)重要[10]，因此我們通過Western blot技術(shù)檢測了MAPK信號通路的激活情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-13處理后，肺上皮細胞A549的p38磷酸化水平增加(圖3A)，IL-6水平升高(P<0.05， 圖4)；用不同濃度的p38磷酸化特異性抑制劑SB203508(10 μmol/L、20 μmol/L)預(yù)處理A549細胞1 h后再用IL-13(100 ng/ml)處理，結(jié)果顯示，與模型組相比，p38抑制劑處理組IL-6水平顯著降低(P<0.05，圖4)，說明MAPK信號通路參與了哮喘模型中IL-6的產(chǎn)生。為探究PGRN對MAPK信號通路的影響，在體外哮喘模型的基礎(chǔ)上，再給予rhPGRN處理，結(jié)果顯示，rhPGRN抑制IL-13對上皮細胞p38磷酸化的激活(圖3B)及IL-6的分泌(P<0.05，圖4)。這些結(jié)果表明，在體外哮喘炎癥模型中rhPGRN通過抑制p38磷酸化從而降低炎癥因子IL-6的表達。

Fig. 3 The levels of p38 phosphorylation detected by Western blot after treatment with IL-13/ IL-13 + rhPGRN

Fig. 4 The levels of IL-6 secreted by A549 cells with different treatment

2.5 IL-6 ko哮喘小鼠中PGRN的表達

有文獻報道IL-6可促進中性粒細胞的募集[9]，而中性粒細胞彈性蛋白酶可降解PGRN[11]，因此我們推測在哮喘小鼠中，IL-6可能促進了中性粒細胞彈性蛋白酶對PGRN的降解。為了驗證該推測，我們采用IL-6 ko小鼠構(gòu)建哮喘模型，結(jié)果顯示，與野生哮喘小鼠相比，IL-6 ko哮喘小鼠BALF細胞總數(shù)降低(P<0.05，表7)，各類白細胞分類計數(shù)也降低，其中中性粒細胞降低顯著(P<0.05，表7)；支氣管周圍、肺泡及血管間隙的炎癥細胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)完整性較好，出血也減少(圖5)。這些結(jié)果說明IL-6 ko小鼠的哮喘氣道炎癥得到顯著改善。

同時我們檢測了小鼠體內(nèi)PGRN的表達，結(jié)果顯示，與野生哮喘小鼠相比，IL-6 ko哮喘小鼠肺組織中PGRN mRNA表達無差異(表8)，BALF中PGRN蛋白水平明顯增高(P<0.05，表8)，表明在小鼠哮喘模型中IL-6并不影響PGRN的產(chǎn)生，但IL-6 ko鼠BALF中PGRN蛋白水平增高，其原因可能是IL-6敲除后中性粒細胞的募集減少，從而使PGRN降解減少。

Fig. 5 Photomicrographs of HE-stained lung tissue sections of wild mice and IL-6 ko mice

Tab. 7 Total inflammatory cells and the differential cell counts in BALF of wild mice and IL-6 ko mice (×104, n=8)

Tab. 8 PGRN mRNA levels in lung tissue and PGRN protein levels in BALF of wild mice and IL-6 ko mice n=8)

3 討論

PGRN不僅在機體生長發(fā)育、傷口修復(fù)和炎癥反應(yīng)等生理活動中發(fā)揮著重要作用，同時還參與了眾多疾病的病理過程[12]。在多種疾病中，PGRN的表達均增加，如乳腺癌[13]、畸胎瘤[14]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[15]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]及肺炎[17]等。然而哮喘患者體內(nèi)PGRN水平較健康人降低，其具體機制尚不清楚。

本研究構(gòu)建了小鼠混合型哮喘模型，即BALF中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞均明顯增多。與對照組相比，哮喘小鼠肺組織和BALF中PGRN水平均顯著降低，血清中PGRN蛋白也有降低的趨勢，這與哮喘患者體內(nèi)PGRN變化趨勢基本一致。在體外哮喘模型中，與對照組相比，PGRN的mRNA及蛋白水平均降低。體內(nèi)外實驗均顯示哮喘發(fā)生后PGRN的mRNA水平降低，表明PGRN的產(chǎn)生減少。

與哮喘相似，慢性阻塞性肺氣腫(COPD)血清中PGRN水平也明顯低于健康人，有學(xué)者認為是由于COPD患者體內(nèi)增多的中性粒細胞所產(chǎn)生的彈性蛋白酶對PGRN有降解作用[18]。在哮喘氣道炎癥中，除了少見的寡細胞型外，中性粒細胞為主型、嗜酸性粒細胞為主型及混合型哮喘中，其中性粒細胞數(shù)量均高于正常人。那么哮喘患者體內(nèi)PGRN水平降低，是否也與中性粒細胞彈性蛋白酶的降解作用有關(guān)？

IL-6是參與哮喘免疫應(yīng)答的重要炎癥分子之一，可由固有免疫細胞( 如巨噬細胞、樹突狀細胞和ILC2 細胞)及結(jié)構(gòu)細胞( 如上皮細胞和內(nèi)皮細胞)等分泌[19]。已知IL-6可促進Th17細胞極化，Th17產(chǎn)生IL-17促進中性粒細胞的募集[6, 12]。有研究表明哮喘患者血清IL-6水平越高病情越嚴重[20]，阻斷IL-6信號通路后減輕了哮喘小鼠氣道炎癥[21]。我們的結(jié)果顯示，與野生哮喘小鼠相比，IL-6 ko哮喘小鼠BALF中性粒細胞數(shù)量顯著降低，其肺部PGRN mRNA水平無明顯改變，但BALF中PGRN蛋白水平升高。這說明在IL-6 ko哮喘小鼠體內(nèi)，PGRN的產(chǎn)生與野生小鼠無差異，PGRN蛋白水平有所回升可能是由于中性粒細胞減少導(dǎo)致了彈性蛋白酶減少，因而PGRN降解減少。綜上，我們認為PGRN在哮喘中表達降低的原因，一方面是PGRN的產(chǎn)生減少，另一方面可能是中性粒細胞彈性蛋白酶對其降解所致，但其具體機制有待進一步研究。

有文獻報道，MAPK可調(diào)節(jié)人體炎癥及免疫反應(yīng)，在肺部炎癥性疾病如COPD和哮喘中，MAPK發(fā)揮著重要作用[10]。我們使用IL-13處理人肺泡上皮細胞A549或支氣管上皮細胞BEAS-2B建立體外哮喘炎癥模型[9]。結(jié)果顯示，與IL-13處理組相比，IL-13與PGRN共同處理組IL-6水平顯著降低，P38的磷酸化水平也顯著降低；與IL-13處理組相比，p38磷酸化抑制劑處理組IL-6水平顯著降低，表明PGRN可通過抑制P38的磷酸化從而降低IL-6水平來減輕哮喘氣道炎癥。

本研究初步闡明了PGRN在哮喘中表達降低的原因及作用機制，為進一步研究PGRN在哮喘發(fā)生發(fā)展中的機制奠定了基礎(chǔ)。