徐立聰， 黃婷婷， 郝家樂， 范小芳， 龔永生， 毛孫忠

(溫州醫(yī)科大學低氧醫(yī)學研究所， 浙江 溫州325035)

肺血管內(nèi)皮細胞損傷及肺血管內(nèi)皮屏障通透性增加是感染性急性肺損傷 (acute lung injury，ALI)發(fā)病重要的病理生理特征[1]，然而有關(guān)ALI時內(nèi)皮細胞屏障通透性增加的信號轉(zhuǎn)導機制目前尚未完全闡明。弗里德白血病病毒插入位點1(Friend leukemia virus integration 1，F(xiàn)LI-1)是Ets(E26 transformation-specific)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要存在于血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、免疫細胞、造血系統(tǒng)及纖維母細胞，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控、胚胎的發(fā)育、細胞的增殖、分化及遷移等[2]，近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LI-1介導的內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)、血管骨架形成和血管生成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。研究表明，ALI時肺血管內(nèi)皮屏障功能失常與Src酪氨酸激酶(Src protein tyrosine kinase，SRC)活化密切相關(guān)[4]，SRC是FLI-1的靶基因蛋白，F(xiàn)LI-1可抑制SRC蛋白表達[5]，尚不清楚FLI-1介導的內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)是否參與感染性ALI所致的肺血管內(nèi)皮屏障功能失常過程。本實驗在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的感染性ALI小鼠模型上，觀察肺血管內(nèi)皮屏障通透性及肺組織FLI-1和SRC蛋白表達水平的變化，探討FLI-1在感染性ALI肺血管內(nèi)皮屏障功能失常過程中的變化及可能意義，旨在為感染性ALI的發(fā)病機制及治療提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級野生型雄性ICR小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號SCXK(滬2017-0063)，EscherichiacoliLPS(0111:B4，Sigma公司)，F(xiàn)LI-1抗體和SRC抗體(ABclonal公司)，GAPDH(CST公司)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒(上海江萊生物)，F(xiàn)ITC-BSA和TRITC-BSA(西安齊岳生物)。

1.2 動物模型制備

SPF級野生型雄性ICR小鼠60只，腹腔注射LPS 7.5 mg/kg，分別在給予LPS 0 h(n=18)、12 h(n=12)、24 h(n=18)、48 h(n=12)后取材。

1.3 肺血管內(nèi)皮屏障通透性檢測

動物處死前30 min經(jīng)尾靜脈給予伊文思藍(20 mg/kg)。沖洗干凈血管中的血液，肺組織烘干稱重；制備肺組織勻漿，5 000 r/min離心30 min，分別在620 nm和740 nm檢測上清液的熒光強度，以620 nm處的熒光強度與肺干重的比值(U/mg)作為肺血管內(nèi)皮屏障通透性的指標[6]。

在肺血管內(nèi)皮屏障通透性與肺組織FLI-1相關(guān)性分析的實驗中，采用雙熒光蛋白追蹤法檢測肺血管內(nèi)皮屏障通透性，取LPS 0 h和24 h各6只小鼠，麻醉后固定，暴露頸靜脈竇，注入5 μl FITC-BSA；2 h后給予4 μl TRITC-BSA，2 min后放血處死，收集血漿，肝素生理鹽水沖洗干凈血管中的血液，收集部分肺組織標本于-70℃保存，待測FLI-1和SRC蛋白表達；制備肺組織勻漿，500 r/min離心5 min，檢測血漿和上清液中FITC(EX：490～495 nm，EM：520～530 nm)和TRITC(Ex：547 nm，Em：572 nm)的熒光強度，用[上清液FITC-BSA熒光強度/血漿FITC-BSA熒光強度-上清液TRITC-BSA熒光強度/血漿TRITC-BSA熒光強度]/肺組織重量來反映肺血管內(nèi)皮屏障通透性。

1.4 肺濕干重比檢測

取肺組織，稱其濕重，然后置于65℃的恒溫烤箱烘烤至恒重，再次稱重獲得此肺組織的干重，計算肺濕重/干重比值(wet/dry weight ratio，W/D)。

1.5 肺泡灌洗液制備

暴露氣管，行氣管插管，用EDTA-生理鹽水經(jīng)支氣管行肺泡灌洗3次，每次0.5 ml。待注入生理鹽水后，輕輕按摩肺組織30 s，回收肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，并計錄BALF回吸收率(保證回收率在90%以上)?；靹?，3 000 r/min離心5 min，取上清于-70℃保存待測。

1.6 肺泡灌洗液指標檢測

ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6含量，按照試劑盒說明書操作。

1.7 肺組織蛋白表達檢測

Western blot法檢測蛋白表達水平，肺組織加RIPA裂解液1 ml，玻璃勻漿器研磨，制備組織總蛋白樣品。經(jīng)SDS-PAGE Bio-Rad電泳分離(上樣總蛋白量為30 μg)，4℃電轉(zhuǎn)膜過夜，封閉后加入FLI-1(1∶1 000)一抗或SRC(1∶1 000)一抗，二抗，采用超敏型化學發(fā)光檢測試劑盒，Bio-Rad成像儀拍照成像，用Image Lab 4.0圖像分析軟件分析處理。以GAPDH為內(nèi)參照物，計算待測條帶吸光度與GAPDH吸光度的相對比值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺血管內(nèi)皮屏障通透性的改變

與0 h組比較，12 h組、24 h組、48 h組肺血管內(nèi)皮屏障通透性分別升高74.3%、162.4%、 91.6%，而48 h組較24 h組降低27.0%(P均< 0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of Evans blue content and W/D in lung tissues among different n=6)

2.2 小鼠肺組織濕干重比的改變

與0 h組比較，12 h組、24 h組、48 h組肺濕干重比分別升高50.1%、122.9%、99.1%，而48 h組較24 h組降低10.7%(P均<0.05，表1)。

2.3 小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量的改變

與0 h組比較，12 h組、24 h組、48 h組BALF中IL-6含量分別升高8.6倍、16.8倍和11.7倍，TNF-α含量分別升高4.1倍、6.7倍和5.0倍，而48 h組BALF中IL-6、TNF-α含量較24 h組分別降低28.3%和21.6%(P均<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of IL-6 and TNF-α contents in BALF among different n=6)

2.4 小鼠肺組織FLI-1、SRC蛋白表達的改變

與0 h組比較，12 h組、24 h組、48 h組肺組織FLI-1蛋白表達水平分別下調(diào)20.4%和56.9%，而48 h組較24 h組上調(diào)18.2%(P均<0.05)；與0 h組比較，12 h組、24 h組、48 h組肺組織SRC蛋白表達水平分別上調(diào)76.8%、176.7%、84.2%，而48 h組較24 h組下調(diào)33.4%(P均<0.05，圖1，表3)。

Fig. 1 The protein levels of FLI-1 and SRC in lung tissues of mice were determined by Western blot

Tab. 3 Comparison of relative levels of FLI-1 and SRC of mice among different n=3)

2.5 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示：小鼠肺血管內(nèi)皮屏障通透性與肺組織FLI-1蛋白表達呈顯著負相關(guān)(r= -0.8992，P<0.01)；與SRC蛋白表達呈顯著正相關(guān)(r=0.8918，P<0.01)；肺組織FLI-1與SRC蛋白表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.8087，P=0.0014，圖2A，2B，2C)。

Fig. 2 Correlation analysis of endothelial permeability and FLI-1, SRC protein expressions in mice

3 討論

感染性ALI主要病理學特征之一是肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能破壞及肺血管內(nèi)皮通透性增加，在膿毒癥引起的ALI過程中，LPS介導起重要作用。LPS是格蘭氏陰性細菌壁的結(jié)構(gòu)成分，是促炎癥介質(zhì)，LPS誘導的內(nèi)皮細胞屏障功能失調(diào)與肌動蛋白的重新組織和骨架蛋白的破壞參與細胞一細胞、細胞一外基質(zhì)黏附過程有關(guān)，目前感染性ALI時內(nèi)皮細胞屏障通透性增加的信號轉(zhuǎn)導機制尚未完全闡明。

本實驗結(jié)果顯示：LPS刺激后0～24 h肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著升高，肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量亦顯著升高，LPS刺激24 h為ALI損傷期；與LPS刺激24 h比較，LPS刺激48 h后肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著減低，肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量亦顯著降低，LPS刺激24 h～48 h為ALI修復(fù)期，這與本實驗以前的結(jié)果一致[6]，提示ALI模型復(fù)制成功。但本實驗結(jié)果顯示：在ALI損傷期，肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著升高，而肺組織FLI-1蛋白表達顯著下調(diào)，并且肺血管內(nèi)皮屏障通透性與肺組織FLI-1蛋白表達呈顯著負相關(guān)；在ALI修復(fù)期，肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著減低，而肺組織FLI-1蛋白表達顯著上調(diào)。FLI-1是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要存在于血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、免疫細胞、造血系統(tǒng)及纖維母細胞中，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控、胚胎的發(fā)育、細胞的增殖、分化及遷移，目前主要集中在血管和血細胞生成、腫瘤及系統(tǒng)性硬皮病方面的研究[2]。以往研究表明，F(xiàn)LI-1調(diào)控血管內(nèi)皮細胞間黏附連接相關(guān)蛋白基因，如血小板內(nèi)皮細胞黏附因子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1)、VE-Cadherin等的表達，F(xiàn)LI-1基因敲除小鼠上述細胞黏附連接相關(guān)蛋白基因表達顯著下調(diào)，同時皮膚脈管系統(tǒng)發(fā)育異常，血管內(nèi)皮屏障通透性顯著增加[7]；據(jù)報道，F(xiàn)LI-1介導的內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)態(tài)和血管生成中起重要的調(diào)控作用[3]，LPS經(jīng)TLR4受體途徑下調(diào)微血管內(nèi)皮細胞FLI-1蛋白表達，LPS或沉默F(xiàn)LI-1基因可誘導人真皮微血管內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，抑制微血管內(nèi)皮細胞的增殖和微血管的生成，而用TGF-β中和抗體預(yù)處理或重新表達FLI-1基因可抑制微血管內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，促進微血管內(nèi)皮細胞的增殖和微血管的生成[8]，提示ALI損傷期肺血管內(nèi)皮屏障通透性升高可能與肺組織FLI-1蛋白表達下調(diào)有關(guān)，ALI修復(fù)期肺血管內(nèi)皮屏障通透性改善可能與肺組織FLI-1蛋白表達上調(diào)有關(guān)，F(xiàn)LI-1介導的內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)可能參與感染性ALI肺血管內(nèi)皮屏障功能失常過程，具體機制有待進一步闡明。

本實驗結(jié)果還顯示：在ALI損傷期，肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著升高，肺組織SRC蛋白表達亦顯著上調(diào)，肺血管內(nèi)皮屏障通透性與肺組織SRC蛋白表達呈顯著正相關(guān)；在ALI修復(fù)期，肺血管內(nèi)皮屏障通透性顯著減低，肺組織SRC蛋白表達亦顯著下調(diào)。以往研究已表明，SRC在維持肺血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，SRC可磷酸化肌球蛋白輕鏈[9]或破壞VE-cadherin 與其相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)如 p120-catenin 和β-catenin 的連接[10]，或使VE-Cadherin磷酸化并內(nèi)化[11]進而導致肺血管內(nèi)皮屏障通透性升高[12]，而抑制SRC可改善肺血管內(nèi)皮屏障通透性[13]；研究發(fā)現(xiàn)SRC是FLI-1的靶基因蛋白，F(xiàn)LI-1抑制SRC蛋白表達[5]，本實驗結(jié)果也顯示肺組織SRC與FLI-1蛋白表達呈顯著負相關(guān)，提示FLI-1可能經(jīng)SRC介導內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)參與感染性ALI肺血管內(nèi)皮屏障功能失常過程。有關(guān)上調(diào)FLI-1是否具有防治感染性ALI的作用及其具體的分子機制有待進一步的研究。

綜上所述，F(xiàn)LI-1可能參與感染性ALI肺血管內(nèi)皮屏障功能失常過程。進一步研究FLI-1在感染性AL肺血管內(nèi)皮屏障功能失常中的作用，不僅有助于擴展對ALI發(fā)病機制的認識，而且可為ALI的防治提供新的思路。