楊向君， 王 羽， E.巴雅日瑪， 趙 明， S.賀希格扎日嘎拉

(1. 蒙古國國立醫(yī)科大學國際蒙醫(yī)學院, 烏蘭巴托999097-15160， 蒙古； 2. 內蒙古民族大學附屬醫(yī)院, 通遼 028002， 中國； 3. 內蒙古民族大學醫(yī)學院, 通遼 028000， 中國； 4. 蒙古國國立醫(yī)科大學生物醫(yī)學院， 烏蘭巴托999097-15160， 蒙古)

缺血性心臟病，特別是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是導致心力衰竭和致死的重要原因之一[1]。其表現(xiàn)包括發(fā)熱、持久的胸骨后劇烈疼痛、心肌相關的壞死標記物表達增多、患者心電圖發(fā)生改變，具有發(fā)病率高、死亡率高等特點。現(xiàn)代醫(yī)學在急性心肌梗死(AMI)的治療中，早期再灌注是最關鍵的環(huán)節(jié)，但大量的臨床和實驗室研究證實，再灌注會進一步損傷心肌。目前，冠脈再灌注雖然快速緩解急性心肌梗死病人的癥狀，但是對于心肌缺血/再灌注損傷的機制理解還不夠徹底，仍缺少有效治療心肌缺血/再灌注損傷的方法。如何降低I/R損傷所帶來的負性作用，目前已成為心血管領域的研究熱點。

機制研究比較多的包括氧化應激。當機體內的活性氧(reactive oxygen species，ROS)出現(xiàn)過多現(xiàn)象時，機體的抗氧化能力會出現(xiàn)下降。而當心肌發(fā)生缺血/再灌注的過程中，會產生過多的ROS。過多的ROS進一步損傷心肌細胞，導致心肌細胞壞死或凋亡[2-4]。已證實,心肌缺血/再灌注時會導致心臟進一步惡化，其中包括心律失常、心功能下降等，其機制可能主要涉及氧自由基損傷[5]。

缺血/再灌注損傷機制復雜，其中炎性反應也會發(fā)揮一定的作用[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在缺血/再灌注損傷時表達會突然增加，而采取一定的手段減少心肌炎癥因子的釋放后，心肌細胞的損傷出現(xiàn)減輕現(xiàn)象[7]。

紹沙七味丸出自《經驗方》，記載于《中國醫(yī)學百科全書·蒙醫(yī)學》，被內蒙古民族大學附屬醫(yī)院一直廣泛應用于臨床實踐治療心肌梗塞，蒙醫(yī)臨床上療效較好的常用方劑，深受蒙醫(yī)專家們的推崇。紹沙七味丸對心肌梗塞作用機制尚不清楚，本實驗以大鼠為研究對象，建立心肌梗死動物模型后采用紹沙七味丸進行干預并探索其相關機制，為臨床應用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

70只體重(280±20)g雄性SD大鼠，購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心，許可證號：SCXKs(吉)2011-0004。麻醉藥品氨基甲酸乙酯購買自天津百倫斯生物技術有限公司。蒙藥紹沙-7味丸為內蒙古民族大學附屬醫(yī)院院內制劑。BL-420生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司。血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸激酶(CK-MB)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、血清乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒購置于天津碧云天公司。5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)獲取于Solarbio公司。NF-кB來自Cell Signaling公司。光學顯微鏡( Olympus)。

1.2 動物分組與給藥

將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組(2 ml/100 g蒸餾水灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸低劑量組(0.4 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸中劑量組(0.8 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、蒙藥紹沙-7味丸高劑量組(1.6 g/kg劑量的蒙藥紹沙-7味丸混懸液灌胃，1次/日)、陽性對照組(0.3 g/kg劑量的復方丹參片混懸液灌胃灌胃，1次/日)，每組10只。飼養(yǎng)條件為室溫(22±1)℃、濕度(45%～55%)的環(huán)境，一天陽光照射12 h左右。連續(xù)灌胃15 d后，模型組、紹沙-7味丸(低、中、高劑量組)、陽性對照組的大鼠進行造模，造模前進行心電圖檢測，心電圖異常的大鼠剔除。腹腔內注射濃度30 g/L戊巴比妥鈉將大鼠(1.5 ml/kg)麻醉。實驗大鼠麻醉成功后、固定后記錄心電圖，將大鼠頸部、胸部皮膚剃毛，并進行消毒。將頸部正中切開皮膚后暴露大鼠的氣管部分，橫向破開氣管2～3 mm，然后插管連接ALC-V型動物呼吸機，并對其行機械輔助通氣。潮氣量設定為7.5 ml/kg，頻率設定為70～80次/分，呼∶吸=5∶4。剪開左側胸部皮膚后，沿左側3-4肋間打開胸腔，開胸并牽拉胸壁，心包膜剪開暴露心底部，找到冠狀動脈左前降支，取5.0帶縫合針線在此處穿線并打活結阻斷前降支血流。結扎后，迅速將心臟送回胸腔并關閉。阻斷冠狀動脈左前降支血流30 min后，解開活結恢復冠脈左前降支血流后再灌注120 min。

1.3 大鼠心肌的病理觀察

大鼠心肌缺血/再灌注120 min后，將大鼠處死并在無菌狀態(tài)下打開大鼠左肋，去除心包后，取出心臟，將心臟的左心室肌組織放入直接切片后置于含2% TTC的0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4)中，進行TTC染色；取心臟左心室部分放入到含4% 多聚甲醛溶液中進行固定，處理后，進行HE染色，在光鏡下進行觀察病理變化。

1.4 ELISA法檢測大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-Px及TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β的水平

取血清復溫后，根據試劑盒說明書檢測血清中cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-Px及TNF-P、IL-18、IL-6、IL-18的水平。

1.5 免疫組化法檢測大鼠心室肌組織中的NF-кB蛋白水平

左心室肌組織進行切片后，將其放入含4%多聚甲醛溶液中固定，切片處理后，脫蠟水化、抗原修復、內源性過氧化物酶的滅活后，正常1%BSA山羊血清封閉液，室溫下孵育30 min以封閉，洗去封閉液，加稀釋的一抗。切片放于濕盒中，4C孵育過夜，將切片置于PBS中浸泡沖洗3次，每次2 min。擦干切片后，添加二抗。室溫下孵育1 h。PBS洗3次，每次2 min，將DAB濃縮液稀釋，在切片的標本處滴加50 μl的顯色液，馬上置于顯微鏡下觀察，看到有棕黃色的顆粒出現(xiàn)后馬上將切片置于自來水中終止反應。最后蘇木素復染、分化、返藍、脫水、透明、封片。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠心電圖的影響

結扎冠狀動脈后大鼠心電圖變化，R波消失，ST段弓背抬高，而解開結扎線行再灌注后，ST段回落并出現(xiàn)明顯再灌注心律失?，F(xiàn)象，而提前灌胃給予蒙藥紹沙-7味丸和陽性藥緩解大鼠再灌注后的心律失常(圖1)。

2.2 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響

比較假手術組大鼠的心臟(0%±0%)，I/R損傷大鼠(54.74% ±4.05%)的心肌梗死面積明顯變大，差異顯著；而提前灌胃給予不同劑量蒙藥紹沙-7味丸(低44.38% ±4.14%；中36.27% ±6.02%；高27.72% ±5.97%)和陽性藥(15.05% ±3.61%)的大鼠心肌梗死面積顯著縮小，具有劑量依賴性(圖2)。

Fig. 1 Changes of electrocardiogram in rats of different groups

Fig. 2 Comparison of the infarct area between the different groups

2.3 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠心肌組織形態(tài)學的影響

與假手術組大鼠比較，I/R損傷大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質水腫，而提前灌胃給予蒙藥紹沙-7味丸和陽性藥的大鼠心臟心肌纖維紊亂，水腫現(xiàn)象有所緩解(圖3)。

Fig. 3 Histopathological changes of myocardium in rats of each group under light microscopy

2.4 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、SOD、GSH-PX水平的影響

與假手術組比較，I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯增加、SOD顯著減少，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽性藥組大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯減少、SOD顯著增加(表1)。

2.5 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β水平的影響

與假手術組比較，I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯增加，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽性藥組大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯減少(表2)。

Tab. 1 The contents of cTnI, CK-MB, LDH, MDA, GSH-PX and SOD in different groups n=10)

Tab. 2 The contents of TNF-α, IL-18, IL-6 and IL-1β in different groups (pg/ml, n=10)

2.6 蒙藥紹沙-7味丸對I/R損傷大鼠心臟組織NF-кF蛋白表達水平的影響

與假手術組比較，I/R損傷大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達增高；與模型組相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組和陽性藥組大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達減少(圖4)。

3 討論

心血管疾病是全球造成死亡的最主要原因，由于人口的快速增長預計在2002年至2030年，年均每百萬人口因心血管疾病的死亡率將從16.7人增加到23.3人。急性心肌梗死(acute myocardial Infarction，AMI)是因為冠狀動脈的急性閉塞引起的冠脈血流急劇減少或中斷，導致部分的心肌因嚴重長時間的缺血出現(xiàn)局部壞死，而這些壞死的心肌被纖維化瘢痕組織代替，失去了原有的收縮功能，逐步發(fā)展為心律失常、休克或心力衰竭，嚴重可致死亡。近年來，治療AMI的方法包括動脈搭橋術、溶栓療法等手段，這些方法的建立和推廣應用，使得AMI缺血心臟能在短時間內重新獲得血液灌注并恢復氧供應。早期開通閉塞的冠脈，迅速恢復冠脈血流可以減少心肌壞死范圍，保護并挽救缺血心肌，改善預后，降低病死率。但大量的臨床和實驗室研究證實，再灌注會進一步損傷心肌，目前AMI引起的心肌損傷被公認為是心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。目前，冠脈再灌注雖然快速緩解AMI病人的癥狀，但是對于I/R損傷的機制理解還不夠徹底，仍缺少有效治療心肌缺血再灌注損傷的方法。傳統(tǒng)蒙醫(yī)學并無急性心肌梗死(AMI)病名。根據其病因病機、癥狀體征蒙醫(yī)認為AMI是吉如很哈特拉嘎(粘盛)范疇。主要癥狀為心慌氣短，心前區(qū)灼熱，胸痛徹背，心痛如刀割，重者暈厥。蒙藥紹沙-7味丸出自《經驗方》，記載于《中國醫(yī)學百科全書·蒙醫(yī)學》，被內蒙古民族大學附屬醫(yī)院一直廣泛應用于臨床實踐，蒙醫(yī)臨床上療效較好的常用方劑，深受蒙醫(yī)專家們的推崇。由廣棗、丁香、沉香、肉豆蔻、廣木香、阿魏和兔心配合組成。具有抑心赫依、安神定志、增強心功能之功效，主治胸痛、心赫依、心悸、心衰、氣喘等病癥[8]。方中以行氣活血，養(yǎng)心，鎮(zhèn)靜作用的廣棗為主，安神寧心作用的野牛心為輔，配以沉香以祛心赫依熱，丁香以抑主脈赫依，肉豆蔻、阿魏抑心赫依，廣木香以調理體素，平氣血不和，止痛為佐使[9]。諸藥共奏，有行氣止痛，活血化瘀之功效。蒙醫(yī)針對該病的治療采用辨證施治，強心鎮(zhèn)痛，促進清濁分化，改善全身赫依血運行，活血化瘀，舒暢血脈之瘀滯，通過調理整體以調節(jié)三根失衡，使患者的機體赫依血功能紊亂、清不消化得到糾正，進而控制了本病的進一步發(fā)展[10]。本實驗采用不同劑量的蒙藥紹沙-7味丸提前灌胃給予大鼠后，再建立心肌梗塞模型，發(fā)現(xiàn)蒙藥紹沙-7味丸改善心肌缺血再灌注大鼠心律失?，F(xiàn)象，減少梗死面積及降低心肌組織的損傷。說明蒙藥紹沙-7味丸可有效緩解I/R損傷。

I/R損傷的機制涉及中性粒細胞浸潤、鈣超載、能量代謝障礙等多種學說，其中氧化應激學說是當前研究熱點[11]。當機體內ROS的含量過多的時候，氧化應激產生，I/R損傷的整個過程都伴隨著氧化應激。已證實,心肌缺血/再灌注將引起心臟發(fā)生病理性改變包括心功能減低，心律失常等，這些心臟的病理改變都與氧化應激相關[5]。結果表明，I/R損傷大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯增加、SOD顯著減少，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽性藥組大鼠血清cTnI、CK-MB、 LDH、MDA、GSH-PX明顯減少、SOD顯著增加。心肌IR機制復雜，炎性反應同樣起著關鍵的作用[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)與假手術組比較，I/R損傷大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯增加，與I/R損傷大鼠相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組及陽性藥組大鼠血清TNF-α、IL-18、IL-6、IL-1β明顯減少。炎癥相關蛋白NF-κB作為快速反應基因的轉錄激活因子，與多種心血管疾病密切相關，其中就包括動脈粥樣硬化[12]。抑制NF-κB蛋白的活化在一定程度上可以抑制炎癥進而緩解心肌病。本實驗采用免疫組化法，發(fā)現(xiàn)與假手術組比較，I/R損傷大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達增高；與模型組相較，蒙藥紹沙-7味丸治療組和陽性藥組大鼠心臟組織蛋白NF-кB表達減少。表明蒙藥紹沙-7味丸緩解I/R損傷與氧化應激和炎癥相關。

綜上，通過本實驗證明了蒙藥紹沙-7味丸在一定劑量范圍內可以緩解大鼠I/R損傷，其機制與氧化應激和炎癥相關。