丁海麗， 黃增浩， 任在方， 孫竹昕， 李俊平， 王瑞元

(1. 成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院、運動醫(yī)學(xué)與健康研究所， 四川 成都 610041； 2. 北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院， 北京 100084； 3. 中日友好醫(yī)院， 北京 100029； 4. 清華大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院， 北京 100080)

骨骼肌是運動的直接效應(yīng)器官，大負(fù)荷運動尤其是不習(xí)慣的離心運動，會使肌纖維超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，呈現(xiàn)出肌肉僵硬、肌力下降以及主觀感覺疼痛等癥狀和體征，稱為運動性骨骼肌損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)，可引起延遲性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness, DOMS)的亞臨床疼痛現(xiàn)象。EIMD及DOMS若不及時治療，會加劇運動損傷，影響運動表現(xiàn)(exercise performance)以及鍛煉者正常生活[1-3]。EIMD一直以來都是運動醫(yī)學(xué)和運動生理學(xué)研究的熱點問題，尋找有效干預(yù)手段來恢復(fù)或緩解EIMD進(jìn)而減輕DOMS癥狀，對提高運動成績和幫助鍛煉者重返運動場具有重要意義。

針灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法之一，治療骨骼肌損傷歷史悠久、療效確切。研究團(tuán)隊早期由盧鼎厚教授伊始[4]按照《靈樞》中“以痛為腧”治療經(jīng)筋病的記載，采用“阿是穴-斜刺”干預(yù)EIMD，效果顯著。隨后，團(tuán)隊王瑞元等對EIMD和DOMS發(fā)生的機(jī)制以及針刺干預(yù)效應(yīng)與作用靶點進(jìn)行了大量實驗研究，包括骨骼肌收縮蛋白代謝、泛素蛋白酶體途徑[5]、生肌因子表達(dá)[6]、線粒體動力學(xué)[7]以及鈣離子信號等。課題組前期研究[8]證實了運動后針刺可改善骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，逐漸恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高鈣濃度且有效降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)程度，初步探討了Ca2+調(diào)節(jié)機(jī)制與蛋白折疊的協(xié)同效應(yīng)。為了進(jìn)一步探討針刺干預(yù)EIMD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的相關(guān)機(jī)制，本實驗從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能酶學(xué)指標(biāo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PERK通路三方面，綜合分析針刺治療運動性骨骼肌損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑機(jī)制與靶點效應(yīng)，以期為傳統(tǒng)針刺手段介入運動損傷的治療和恢復(fù)提供新的實驗依據(jù)與理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性8周齡Spraque Dawley(SD)大鼠96只，SPF級，體重(225.77±11.03)g，使用許可證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。在北京體育大學(xué)科研中心實驗動物房飼養(yǎng)和訓(xùn)練，自由飲食飲水，室內(nèi)溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即空白對照組(control，C)、單純運動組(exercise，E)、針刺對照組(acupuncture，A)和運動針刺組(exercise+acupuncture，EA)。E組、A組和EA組根據(jù)運動、針刺干預(yù)后不同時相，又分為0 h/12 h/24 h/48 h/72 h各5個亞組，共16個組別，每組6只。

1.2 運動造模方案

參照Armstrong等[9]的離心運動方案，通過一次大負(fù)荷運動建立EIMD模型。使用小動物電動跑臺訓(xùn)練， E組和EA組先進(jìn)行3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，適應(yīng)性訓(xùn)練后開始正式實驗，坡度-16°，速度16 m/min，時間90 min。

1.3 針刺治療方法

運動后即刻對EA和A組大鼠施以針刺干預(yù)。固定器固定大鼠，消毒雙后肢，用直徑0.25 mm的針灸針[漢醫(yī)牌，2009第2270002號]于大鼠小腿跟腱上0.5 cm處沿小腿三頭肌縱向，從遠(yuǎn)端斜刺穿過肌腹，進(jìn)針角度約30°，留針2 min。課題組前期研究中，通過小腿三頭肌局部解剖學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，此方案可復(fù)制損傷肌肉——比目魚肌(長時間運動主要動員的慢肌之一)的模型。

1.4 取材與樣本采集

在各組對應(yīng)時相將大鼠稱重后腹腔麻醉，按 3.5 ml/kg體重注射10%水合氯醛)，經(jīng)腹主動脈取血后，迅速分離比目魚肌。冰冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，剔除結(jié)締組織。左側(cè)取2 mm×3 mm組織塊投入2.5%戊二醛固定液，制備電鏡樣品，剩余組織剪碎后組織勻漿，待測ELISA實驗；右側(cè)組織置于液氮迅速冷凍后-80℃冰箱保存，待測Western blot實驗。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 透射電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)：取C組、A組、E組和EA組大鼠制備電鏡樣品，經(jīng)戊二醛固定，鋨酸再固定，丙酮溶液脫水，環(huán)氧樹脂Spurr包埋后，制備超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色。采用H-600IV型透射電子顯微鏡觀察骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定SERCA、PDI含量：在酶標(biāo)板空白孔中加入100 μl樣品，空白對照加入100 μl蒸餾水，各孔加入50 μl酶標(biāo)記溶液，密封后37℃孵育1 h；洗滌并拍干，加顯色劑A、B各50 μl，室溫避光10 min；加50 μl終止液，置于酶標(biāo)儀30℃孵育2 h；在550 nm波長處每隔1 min連續(xù)測定各孔光密度OD值。

1.5.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測GRP78、p-PERK和p-eIF2α表達(dá)：BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，配制12%分離膠，5%濃縮膠，上樣量20 μg/well；濃縮膠恒壓90 V，約20 min，分離膠恒壓120 V。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。封閉PVDF膜。5%BSA-TBST稀釋一抗(1∶1 000)，5%BSA-TBST稀釋HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶10 000)。膠片曝光，顯影，定影。使用圖像分析軟件Image J檢測各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，將目的蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 針刺對各組大鼠肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

C組肌節(jié)清晰，A帶與I 帶分界清楚、排列規(guī)則，Z 線整齊且兩側(cè)線粒體均勻分布。A組各時相肌小節(jié)、Z線以及線粒體排列與C組相近，無明顯變化。E組0 h～48 h出現(xiàn)不同程度的Z 線加寬、斷裂，明暗帶分界不清，線粒體腫脹并聚集在肌膜下，72 h雖有所緩解，但仍未完全恢復(fù)。EA組對應(yīng)時相比E組超微結(jié)構(gòu)均明顯改善，在72 h肌節(jié)結(jié)構(gòu)整齊，未見Z 線和Z 線斷裂，線粒體在肌膜兩側(cè)排列整齊(圖1)。

2.2 針刺對各組大鼠肌組織SERCA含量的影響

與C相比，A組各時相SERCA含量均無顯著變化(P>0.05)；E組SERCA含量呈降低后逐漸回升趨勢、在0 h、12 h、24 h和48 h均顯著降低(P< 0.05)；EA組SERCA含量雖有所降低但48 h已無顯著差異(P>0.05)。與E組對應(yīng)時相相比，EA組SERCA含量在48 h和72 h顯著升高(表1)。

Fig. 1 Ultrastructural changes in different phases in each group (×8 000)

2.3 針刺對各組大鼠肌組織PDI含量的影響

與C相比，A組各時相PDI含量均無顯著變化(P>0.05)；E組各時相PDI含量亦無顯著變化(P>0.05)；EA組PDI含量各時相則顯著升高(P< 0.05)。與E組對應(yīng)時相相比， EA組PDI含量0 h至72 h各時相均顯著升高(P<0.05，表2)。

2.4 針刺對各組大鼠肌組織GRP78、p-PERK、p-eIF2α表達(dá)的影響

與C組相比， A組GRP78表達(dá)各時相均無顯著變化(P>0.05)；E組GRP78表達(dá)在運動后均處于較高水平，0 h、12 h、24 h、48 h和72 h均顯著升高(P<0.05)；EA組僅在0 h顯著升高(P<0.05)。與E組對應(yīng)時相相比，GRP78表達(dá)均顯著降低(P<0.05，表3，圖2)

Fig. 2 Comparison of GRP78 protein expression in different phases of each group

2.5 針刺對各組大鼠肌組織p-PERK和p-eIF2α表達(dá)的影響

與C組相比，A 組p-PERK和p-eIF2α表達(dá)各時相均無顯著變化(P>0.05)；E組p-PERK和p-eIF2α表達(dá)在運動后0 h、12 h和24 h顯著升高(P<0.05)；EA組僅在0 h顯著升高(P<0.05)。與E組對應(yīng)時相相比，p-PERK和p-eIF2α表達(dá)12 h和24 h顯著降低(P<0.05，表4，圖3，表5，圖4)

Tab. 1 Comparison of SERCA content in different phases of each group (ng/ml， n=6)

Tab. 2 Comparison of PDI content in different phases of each group (ng/ml， n=6)

Tab. 3 Comparison of GRP78 protein expression in different phases of each group(% C group， n=6)

Tab. 4 Comparison of p-PERK protein expression in different phases of each group(% C group， n=6)

Tab. 5 Comparison of p-eIF2α protein expression in different phases of each group(% C group， n=6)

Fig. 3 Comparison of p-PERK protein expression in different phases of each group

Fig. 4 Comparison of p-eIF2α protein expression in different phases of each group

3 討論

骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工和鈣離子貯存的主要場所，對應(yīng)激極為敏感，耗竭內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+、二硫鍵錯配、突變蛋白質(zhì)表達(dá)等均可誘發(fā)ERS，運動應(yīng)激能夠引起骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+通道及相關(guān)酶功能改變，且與EIMD的發(fā)生密切相關(guān)[10-13]。目前關(guān)于針刺干預(yù)EIMD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作用途徑的研究主要集中Ca2+調(diào)節(jié)方面，而對其另一功能——蛋白折疊修飾，則涉及較少。因此，本研究著重觀察針刺對運動誘導(dǎo)骨骼肌損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase, PDI)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)和通路蛋白PERK的影響，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑探究針刺治療運動性骨骼肌損傷的作用機(jī)制。

本實驗觀察到針刺可緩解EIMD肌纖維結(jié)構(gòu)改變，改善肌小節(jié)紊亂、線粒體腫脹和肌膜下聚集等。在針刺影響EIMD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵功能方面，運動針刺組的SERCA含量在48 h和72 h顯著高于單純運動組，提示針刺上調(diào)大負(fù)荷運動后SERCA含量方面，并沒有在早期出現(xiàn)，而是48 h或72 h較明顯。推測針刺可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收鈣及恢復(fù)高鈣濃度，但SERCA可能并未及時發(fā)揮針刺的靶點作用?；诖?，本研究對針刺干預(yù)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊功能的二硫鍵異構(gòu)酶PDI也進(jìn)行測定，PDI具有自主異構(gòu)酶活性，并在錯誤折疊蛋白聚集時增多，通過水解二硫鍵而發(fā)揮重要作用[14]。結(jié)果表明，單純運動組PDI含量僅在運動后即刻顯著高于對照組水平，運動針刺組PDI含量在干預(yù)后即刻、12 h、24 h、48 h和72 h均明顯高于運動組。提示運動后進(jìn)行針刺干預(yù)，可明顯提升骨骼肌PDI含量，從而有效應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的未折疊、錯誤折疊蛋白聚集，使其正確折疊和組裝，相對于SERCA的變化情況，PDI的反應(yīng)較為及時和快速，該結(jié)果提示，PDI可能具有一定靶點作用，但其確切作用途徑和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

當(dāng)生物組織細(xì)胞處于缺氧、氧化應(yīng)激等狀態(tài)時，細(xì)胞亞單位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會在一系列信號級聯(lián)反應(yīng)下產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā)ERS和未折疊蛋白反應(yīng)，適度ERS可應(yīng)對細(xì)胞環(huán)境擾動并恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白折疊環(huán)境，過度ERS則引起細(xì)胞功能失調(diào)、自噬或凋亡[15-17]。誘導(dǎo)GRP78生成是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個標(biāo)志特征，非應(yīng)激狀態(tài)下，伴侶分子GRP78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，與蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1, IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(the activating transcription factor, ATF6)三個ERS感受蛋白結(jié)合，處于非活化狀態(tài)[18]。發(fā)生ERS時，GRP78與三個感受器解離從而激活三條信號通路，引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，當(dāng)應(yīng)激時間過長或強(qiáng)度較大，超出機(jī)體自我調(diào)整能力，即可能引發(fā)細(xì)胞損傷和不良結(jié)局。PERK可感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+水平，通過磷酸化真核細(xì)胞起始因子(eukaryoticinitialion faclor, eIF2α)抑制蛋白合成，mRNA翻譯能力下降，進(jìn)而活化轉(zhuǎn)錄因子4(the activating transcription factor, ATF4)后上調(diào)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)基因表達(dá)，參與細(xì)胞的整合應(yīng)激反應(yīng)過程。目前，已有不少國內(nèi)外學(xué)者對針刺影響PERK通路蛋白的效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了報道。Zhang等研究表明[19]，冬眠松鼠骨骼肌ERS過度引發(fā)的細(xì)胞凋亡可以通過PERK信號通路介導(dǎo)的p-eIF2α和GRP78上調(diào)而緩解。郁潔[20]等研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以下調(diào)實驗性腦缺血大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路重要因子eIF2α的基因表達(dá)，緩解腦缺血性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。本實驗中GRP78的變化表明，針刺可緩解EIMD大鼠骨骼肌ERS，對PERK通路蛋白的檢測結(jié)果表明，針刺可明顯下調(diào)運動后12 h和24 h p-PERK與p-eIF2α表達(dá)，提示PERK具有一定的靶點作用，而對于另外兩條通路IRE1和ATF6的變化趨勢尚有待進(jìn)一步探討。

綜上，針刺可有效緩解EIMD大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)受損情況，其作用機(jī)制可能與上調(diào)PDI及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)。