宋海巖， 周志新， 張玉祥

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng)市分子神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100069)

胰腺星形細(xì)胞即PSCs，因其與肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能而得名[1, 2]。PSCs常常作為體外的細(xì)胞模型用于與胰腺纖維化相關(guān)的疾病研究。本課題組前期的研究結(jié)果顯示Notch3參與調(diào)節(jié)PSCs的活化[3]，利用Notch3 siRNA敲低活化的PSCs中Notch3的表達(dá)后，細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，細(xì)胞的活化程度降低，但是抑制Notch3的表達(dá)后，PSCs中其它基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生哪些改變，如與PSCs的活化相關(guān)的基因，Notch3是否影響參與PSCs的活化的其他信號(hào)通路尚不十分清楚。本研究通過(guò)原代培養(yǎng)小鼠活化的PSCs，利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，敲低活化的PSCs中Notch3的表達(dá)后，對(duì)PSCs轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行并行測(cè)序，檢測(cè)不同條件下細(xì)胞中的基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究影響PSCs活化的機(jī)制，為臨床診斷胰腺癌間質(zhì)細(xì)胞的治療方法的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重20～25 g，雌雄不限，光照時(shí)間按照晝夜更替12 h: 12 h，在室溫條件下自由飲食，直至實(shí)施實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco公司)，青霉素-鏈霉素溶液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，α-SMA抗體(DAKO公司)，F(xiàn)ibronectin抗體，Collagen I抗體(Proteintech公司)，GAPDH抗體(SIGMA公司)，Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-rabbit IgG，Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG(Invitrogen公司)，Notch3 siRNA購(gòu)自于Santa Cruz公司，Notch3 siRNA-1由GenePharma(吉瑪)公司合成,陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA，NC siRNA)購(gòu)自于Santa Cruz公司。

1.3 小鼠PSCs原代培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)[4]取出原代分離培養(yǎng)小鼠PSCs，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h(利于組織貼壁)后加入足量的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔1 d換液。

1.4 細(xì)胞免疫熒光染色

取培養(yǎng)狀態(tài)較好的PSCs棄去培養(yǎng)液，每盤(pán)加入1 ml 0.25% 的胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，離心后制成細(xì)胞懸液。取6孔板1個(gè)，每孔加入無(wú)菌的蓋玻片1張。將吹打均勻的細(xì)胞懸液加到6孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)2 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2遍。4% PFA固定10 min。5% 的驢血清室溫封閉1 h。 加I抗孵育(α-SMA, 1∶100; collagen I, 1∶50; fibronectin抗體1∶50)，4℃孵育過(guò)夜?？雇脽晒猗蚩?94或抗小鼠熒光II抗488 1∶1 000稀釋，室溫避光孵育1 h。DAPI室溫避光孵育5 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光激發(fā)情況，采集圖像。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.5 Notch3 siRNA，Notch3 siRNA-1及NC siRNA轉(zhuǎn)染至PSCs

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PSCs，按照2×105cells/ml的密度鋪種細(xì)胞至6孔板中，在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)培養(yǎng)板中的細(xì)胞融合度達(dá)70-80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組為空白對(duì)照組(MOCK組)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染Notch3 siRNA negative control，NC組)，Notch3 siRNA組(轉(zhuǎn)染Notch3 siRNA，N3 siRNA組)及Notch3 siRNA-1組(轉(zhuǎn)染Notch3 siRNA-1，N3 siRNA-1組)。以100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋適量的 siRNA(Santa Cruz的產(chǎn)品為5 μl，吉瑪?shù)漠a(chǎn)品為2.5 μl)。NC組以100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋5 μl NC siRNA(Santa Cruz的產(chǎn)品)。以100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋5 μl LipofectamineTM2000，混合siRNA與LipofectamineTM，將siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入6孔板中，每孔加入800 μl無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使液體均勻覆蓋細(xì)胞(Notch3 siRNA與Notch3 siRNA-1的終濃度均為50 nmol/L，，陰性對(duì)照siRNA終濃度為50 nmol/L)，空白對(duì)照組只加1 ml無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液。37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，各組均更換含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h的PSCs提取總RNA。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.6 RNA提取及檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染48 h的PSCs，利用Trizol Reagent裂解細(xì)胞，冰上裂解5 min。將各組Trizol裂解液中的細(xì)胞吸至無(wú)RNA酶的1.5 ml Ep管中，先后加入三氯甲烷，異丙醇及75% 乙醇提取RNA。最后小心棄去上清，敞開(kāi)管蓋于室溫干燥5～10 min，以20～30 μl無(wú)RNA酶水溶解RNA，55℃ 金屬浴上加熱5 min以促進(jìn)RNA溶解。取1 μl總RNA用NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度(OD 260/280應(yīng)在1.9～2.1之間)，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)染48 h的PSCs提取總RNA后，測(cè)定RNA濃度及純度后，送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，即RNA-sequencing(RNA-seq)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色檢測(cè)活化的PSCs中α-SMA, Fibronectin及Collagen I 的表達(dá)

研究顯示，活化的PSCs特異性的表達(dá)α-SMA，并合成分泌大量的Collagen I和Fibronectin，本研究對(duì)培養(yǎng)10 d活化的PSCs進(jìn)行免疫熒光染色的結(jié)果顯示，培養(yǎng)10 d的活化的PSCs中α-SMA，F(xiàn)ibronectin及Collagen I都有明顯的表達(dá)(圖1)。DAPI可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，DAPI的發(fā)散光為藍(lán)色，顯微鏡下看到顯藍(lán)色熒光的為細(xì)胞核，Merged的圖片為與抗體的細(xì)胞和其細(xì)胞核的合成圖片，說(shuō)明與抗體結(jié)合的是細(xì)胞，而非非特異性著色。這些結(jié)果表明，本研究對(duì)活化的PSCs進(jìn)行的原代培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig. 1 The expressions of α-SMA，fibronectin and collagen I in PSCs(n=6)

2.2 總RNA樣品檢測(cè)結(jié)果

RNA-seq對(duì)樣品的純度及濃度均有一定的要求，樣品純度要求：260/280的OD值應(yīng)在1.8至 2.2之間；電泳檢測(cè)28 S∶18 S至少大于1.8。樣品濃度：總RNA濃度不低于400 ng/μg。本研究中提供的樣品檢測(cè)報(bào)告顯示，樣品合格符合建庫(kù)要求(表1)。

Tab. 1 The test results of sample quality

2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)分析

構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析得到上下調(diào)基因個(gè)數(shù)(表2)。N3 siRNA組(N3 siRNA-1)組和N3siRNA NC 組，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，可以很直觀反映出不同實(shí)驗(yàn)條件下樣本差異表達(dá)基因的變化情況(圖2)。表達(dá)量的變化用顏色的變化表示，藍(lán)色表示表達(dá)量較低，紅色表示表達(dá)量較高。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，與NC組相比較，在N3 siRNA組與N3 siRNA-1組，α-SMA基因，collagen I基因，fibronectin基因及CTGF基因均表達(dá)下調(diào)，與膠原蛋白代謝過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，正向調(diào)節(jié)膠原生物合成的基因表達(dá)下調(diào)，而負(fù)向調(diào)節(jié)膠原生物合成的基因表達(dá)上調(diào)，PCNA基因表達(dá)下調(diào)。

Tab. 2 Statistical results of differentially expressed genes obtained from intergroup n=6)

2.4 GO(Gene Ontology，基因本體)分析統(tǒng)計(jì)

GO總共有三個(gè)Ontology，分別描述基因的生物過(guò)程(Biological Process)、細(xì)胞組分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，生物過(guò)程部分中，與NC組相比較，在N3siRNA組與N3siRNA-1組，調(diào)節(jié)細(xì)胞聚集的基因表達(dá)下調(diào)；在細(xì)胞組分部分，細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)下調(diào)(表3)。

Fig. 2 Clustering figure of different genes

Tab. 3 Statistical results of differentially expressed genes obtained from intergroup comparisons

2.5 KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書(shū))是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)比較的通路圖進(jìn)行注釋，紅色表示上調(diào)差異基因，綠色表示下調(diào)差異基因。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的篩選分析發(fā)現(xiàn)，與NC組相比較，Notch3 siRNA組中細(xì)胞粘附分子信號(hào)通路中，表達(dá)上調(diào)的基因有27個(gè)，而表達(dá)下調(diào)的基因有13個(gè)，表明細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)，如圖31所示，Notch信號(hào)通路的活化可直接作用于MAPK信號(hào)通路，與NC組相比較，Notch3 siRNA組在MAPK信號(hào)通路中表達(dá)下調(diào)的基因有14個(gè)，而表達(dá)上調(diào)的基因有6個(gè)，表明抑制PSCs中Notch3的表達(dá)可進(jìn)一步抑制MAPK信號(hào)通路。同時(shí)，與NC組相比較，Notch3 siRNA組TGF-β信號(hào)通路中表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?個(gè)，且無(wú)表達(dá)上調(diào)的基因，表明抑制PSCs中Notch3的表達(dá)可進(jìn)一步抑制TGF-β信號(hào)通路。

3 討論

在正常的胰腺組織中PSCs處于靜息態(tài)，即非活化狀態(tài)；而在各種因素作用下，靜息狀態(tài)的PSCs，可轉(zhuǎn)化成具有肌成纖維細(xì)胞樣(myofibroblast-like)特征的活化狀態(tài)，活化的PSCs在形態(tài)和功能上都發(fā)生較大的變化，如細(xì)胞胞體增大，細(xì)胞突起增多，細(xì)胞形態(tài)的呈現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞特征[5, 6]，特異性的表達(dá)α-SMA，并合成分泌大量的Collagen I和Fibronectin，細(xì)胞增殖、遷移能力增強(qiáng)[7, 8]

活化的PSCs在胰腺纖維化及胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-12]，因此，針對(duì)PSCs的研究越來(lái)越受到研究者的關(guān)注，針對(duì)PSCs的胰腺癌治療方法也可成為臨床胰腺癌治療的新的研究方向。

本研究利用原代培養(yǎng)小鼠正常胰腺星形細(xì)胞作為模型細(xì)胞，免疫熒光染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)10 d的活化的PSCs中α-SMA，F(xiàn)ibronectin及Collagen I均有明顯的表達(dá)。這些結(jié)果表明，本研究對(duì)PSCs進(jìn)行的原代培養(yǎng)成功，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究前期的研究結(jié)果顯示[3]，利用Notch3 siRNA敲低活化的PSCs中Notch3的表達(dá)后，細(xì)胞中α-SMA，F(xiàn)ibronectin及Collagen I的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞遷移增殖的能力也降低，這就提示細(xì)胞的活化程度降低，細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生了改變。那么，利用siRNA敲低PSCs中的Notch3后，為分析PSCs中的其它基因表達(dá)的變化，本研究對(duì)各組PSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sep)。

RNA-sep是高通量檢測(cè)樣本中所有基因表達(dá)的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究中。普通的RNA-sep多用于細(xì)胞的混合樣本的mRNA測(cè)序，對(duì)不同樣本或組別之間的差異表達(dá)分析和差異表達(dá)基因的功能富集分析[13]。本研究中，首先對(duì)樣品的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：各組樣品均符合建庫(kù)要求，可上機(jī)測(cè)序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，與NC組相比較，敲低PSCs中的Notch3表達(dá)后，α-SMA基因、collagen I基因、fibronectin基因及CTGF基因均表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，與膠原蛋白代謝過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，正向調(diào)節(jié)膠原生物合成的基因表達(dá)下調(diào)，而負(fù)向調(diào)節(jié)膠原生物合成的基因表達(dá)上調(diào)，這就表明膠原蛋白的合成能力下降，而且其分解代謝的能力增強(qiáng)，細(xì)胞合成ECM的能力下降，PCNA基因表達(dá)下調(diào)，提示PSCs細(xì)胞增殖能力降低；在GO分析的生物過(guò)程部分中，與NC組相比較，敲低PSCs中的Notch3表達(dá)后調(diào)節(jié)細(xì)胞聚集的基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)下調(diào)，表明細(xì)胞的遷移聚集能力下降，ECM合成的能力下降。

據(jù)眾多的研究報(bào)道，多種信號(hào)通路參與PSCs的活化及功能的調(diào)節(jié)。離子通道 TRPC3 參與PSCs遷移[14]，生長(zhǎng)因子及酒精等可通過(guò)激活MAPKs參與調(diào)節(jié)PSCs的活性[15]，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路[16]，TGF-β/SMAD信號(hào)通路[17-19]等均參與PSCs的活性調(diào)節(jié)。

通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，與NC組相比較，敲低PSCs中的Notch3表達(dá)，細(xì)胞粘附分子信號(hào)通路中，表達(dá)上調(diào)的基因有27個(gè)，而表達(dá)下調(diào)的基因有13個(gè)，表明細(xì)胞的粘附性增強(qiáng)，而遷移聚集的能力下降，MAPK信號(hào)通路中表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?4個(gè)，而表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?個(gè)，表明抑制PSCs中Notch3的表達(dá)可進(jìn)一步抑制MAPK信號(hào)通路；TGF-β信號(hào)通路中表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?個(gè)，且無(wú)表達(dá)上調(diào)的基因，表明抑制PSCs中Notch3的表達(dá)可進(jìn)一步抑制TGF-β信號(hào)通路。

綜上所述，敲低PSCs中Notch3的表達(dá)，可降低PSCs的活化程度，可促進(jìn)ECM的分解代謝，抑制其合成；增強(qiáng)PSCs的粘附能力，降低其遷移聚集能力，降低其增殖能力，這與本研究前期的結(jié)果相一致，抑制PSCs中Notch信號(hào)通路可改變PSCs的生物學(xué)特性。同時(shí)抑制Notch信號(hào)通路可對(duì)MAPK，TGF-β等信號(hào)通路產(chǎn)生影響，其作用尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)PSCs中的上調(diào)基因及下調(diào)基因，將為臨床針對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。