呂 燁， 孫小婉， 張 聰， 欒志琳

(大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院， 遼寧 大連 116044)

人類SOX11基因是轉(zhuǎn)錄因子SOX (SRY-related HMG-box) 超家族C亞族成員，該超基因家族由眾多SRY (sex-determining region of Y chromosome) 相關(guān)基因構(gòu)成，編碼一系列具有DNA結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[1]。

Sox11在發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，這揭示了其在神經(jīng)發(fā)生，神經(jīng)存活和神經(jīng)突生長(zhǎng)中的潛在作用。Sox11一般不表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞，而是表達(dá)于分化特定階段的神經(jīng)元前體和早期分化神經(jīng)元，且隨著神經(jīng)發(fā)育的進(jìn)行而下降[2, 3]。大腦分化成熟后，Sox11僅局限表達(dá)于兩個(gè)特定區(qū)域，即海馬的室管膜下區(qū) (subventricular zone, SVZ) 和海馬齒狀回 (dentate gyrus, DG)，并與神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記物Doublecortin共通表達(dá)于已分化但未成熟的神經(jīng)元前體中，提示Sox11在新生神經(jīng)元的產(chǎn)生過(guò)程中具有階段性的特異性功能[4]。

全基因組范圍內(nèi)的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) (ChIP) 表明，Sox11與胚胎干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元中的許多特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，表明Sox11在神經(jīng)干細(xì)胞 (neural stem cells, NSCs) 向神經(jīng)元的分化中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。除此之外，在皮質(zhì)神經(jīng)元放射性遷移過(guò)程中，Sox11抑制樹(shù)突形態(tài)發(fā)生這一功能在大腦皮層的形成中也發(fā)揮重要作用[6]。

根據(jù)北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所張岱教授課題組在中國(guó)北方漢族人群中進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究 (genome-wide association study, GWAS) 獲得的原始數(shù)據(jù)，提示人類SOX11基因可能是精神分裂癥潛在易感基因。既往我們?cè)诎?05例精神分裂癥患者和1348例健康對(duì)照的中國(guó)漢族人群獨(dú)立樣本中進(jìn)行病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于SOX11基因3’端非翻譯區(qū) (untranslated region, UTR) 或3’端近基因 (near gene) 序列中的6個(gè)SNP位點(diǎn)與精神分裂癥顯著關(guān)聯(lián) (等位基因P值范圍為0.0009到 0.0085)，證實(shí)該基因與精神分裂癥關(guān)聯(lián)，為精神分裂癥的易感基因[7, 8]。

目前，Sox11如何通過(guò)影響神經(jīng)發(fā)育從而導(dǎo)致精神分裂癥的機(jī)制尚不明確，即Sox11在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的功能仍有待進(jìn)一步研究。既往研究顯示，諸多精神分裂癥易感基因均會(huì)影響神經(jīng)元遷移，如DISC1[9]，RELN[10]等。所以，我們有理由推測(cè)，Sox11也可以在神經(jīng)元遷移過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用RNA干擾的方法，在胚胎期小鼠腦內(nèi)SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞中干擾Sox11 mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程，從而降低Sox11的表達(dá)，來(lái)探索Sox11在大腦發(fā)育期，尤其是神經(jīng)元遷移過(guò)程中可能發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

真核細(xì)胞過(guò)表達(dá)pcDNA3.1-Myc-6His載體購(gòu)自美國(guó)INVITROGEN公司；pGEM-T載體購(gòu)自美國(guó)PROMEGA公司；真核細(xì)胞過(guò)表達(dá)pcAGGS-IRES-EGFP載體及RNA干擾pSUPER-GFP載體由同濟(jì)大學(xué)丁玉強(qiáng)教授饋贈(zèng)。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連Takara生物工程公司；熒光定量PCR儀 (美國(guó)ABI公司)；細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀 (美國(guó)AMAXA公司)；冰凍切片機(jī) (美國(guó)LEICA公司)；熒光顯微鏡 (日本OLYMPUS公司)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

擴(kuò)增小鼠和大鼠的Sox11 cDNA全長(zhǎng) (mSox11 cDNA：正向：5'-GCT AGC GAT GGT GCA GCA GGC CGA-3'；反向：5'-AAG CTT ATA CGT GAA CAC CAG GTC G-3'。rSox11 cDNA：正向：5'-GCT AGC GAT GGT GCA GCA GGC CGA-3'；反向：5'-AAG CTT ATA CGT GAA CAC CAG GTC GGA G-3')，并將其克隆到pcDNA3.1-Myc-6His質(zhì)粒和pCAGGS-IRES-EGFP載體中。構(gòu)建小鼠mSox11 shRNA (正向：5'-GAT CCC CGG GAC TGC GCC GCG GGC AAG GTT CAA GAG ACC TTG CCC GCG GCG CAG TCC CTT TTT-3'；反向：5'-AGC TAA AAA GGG ACT GCG CCG CGG GCA AGG TCT CTT GAA CCT TGC CCG CGG CGC AGT CCC GGG-3')，并將其插入pSUPER-GFP載體。表達(dá)和敲除的效率通過(guò)轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞系并用抗SOX11抗體 (sc-518104，美國(guó)SANTA CRUZ公司) 和抗c-Myc抗體 (sc-40，美國(guó)SANTA CRUZ公司) 進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚胎腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株293T (本實(shí)驗(yàn)室保存) 用DMEM(H) 加5% FBS于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 LipofectamineTM2000介導(dǎo)的真核細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度約70%～80%時(shí)，可準(zhǔn)備進(jìn)行LipofectamineTM2000 (美國(guó)INVITROGEN公司) 介導(dǎo)的真核細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用無(wú)血清、無(wú)抗生素Opti-MEM將5 μg DNA質(zhì)粒稀釋至250 μl，輕柔混勻；用無(wú)血清、無(wú)抗生素Opti-MEM將10 μl LipofectamineTM2000稀釋至250 μl；將DNA稀釋液加入LipofectamineTM2000稀釋液中，輕柔混勻室溫靜置20 min；細(xì)胞用無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM洗兩次，緩慢向培養(yǎng)板中加入上述轉(zhuǎn)染液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～6 h；棄去上述轉(zhuǎn)染液，加入含5%胎牛血清 (美國(guó)GIBCO/BRL公司) 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用孕鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所用小鼠品系為C57BL/6。以雌鼠見(jiàn)栓為胎鼠胚胎發(fā)育第0.5日 (E0.5)，胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象為胚胎期第14.5日胎鼠 (E14.5)。所用小鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均遵照大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)及使用管理?xiàng)l例。

1.6 胚胎電轉(zhuǎn)

0.7%戊巴比妥鈉1 ml/kg，腹腔注射麻醉孕鼠。腹部鋪無(wú)菌洞巾，正中切口，取出子宮，將電極未拉制端用內(nèi)徑1.5 mm的聚乙烯軟管套緊，軟管另一端接200 μl 進(jìn)口砂芯tip頭，用口吸住tip頭，先通過(guò)電極最尖端吸入質(zhì)?；旌弦? μl。用無(wú)齒鑷子連帶孕鼠子宮壁固定胎鼠頭，在胎鼠眼睛稍上方進(jìn)玻璃電極，方向朝腦矢狀縫和冠狀縫交點(diǎn)，與皮膚夾角45度方向，約2～3 mm，有突破感時(shí)表明電極已經(jīng)刺入腦室，用口將3組不同的質(zhì)粒混合液 (對(duì)照shRNA質(zhì)粒、mSox11 shRNA質(zhì)粒、mSox11 shRNA干擾恢復(fù)后質(zhì)粒) 緩慢吹出進(jìn)入腦，可以看到腦內(nèi)有倒三角形藍(lán)色形狀出現(xiàn)，表明質(zhì)粒注入了側(cè)腦室。然后將夾狀電極 (Tweezertrode Kit，BTX，尖端直徑7 mm) 放于0.9%生理鹽水中，通電觀察負(fù)極周圍有氣泡產(chǎn)生，表明電極良好，隔子宮壁將胎鼠頭沿橫軸方向 (平行于中縫) 用電極夾緊，正極在被注射質(zhì)粒腦室一側(cè)，給予電刺激，刺激模式為L(zhǎng)V、42 V、50 ms、間隔1 s，共5個(gè)脈沖刺激。每只母鼠轉(zhuǎn)6～8個(gè)胚胎，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各半，刺激結(jié)束后迅速將子宮移回母鼠腹腔，縫合腹膜和皮膚，進(jìn)行麻醉復(fù)蘇，精心飼養(yǎng)。處理胚胎期小鼠 (E14.5) 或出生后小鼠 (P0、P4、P7)，在熒光顯微鏡下觀察鼠腦的大腦皮層部位，轉(zhuǎn)染成功的小鼠可以在腦的表面觀察到綠色熒光細(xì)胞帶，隨即可進(jìn)行免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

按照組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū) (天根科技) 從不同年齡 (E12.5，E14.5，E17.5，P0，P7，P14和P60) 的野生型C57BL/6J小鼠大腦皮質(zhì)中分離總mRNA，測(cè)定其濃度和純度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA (正向：5'-AGA GTT AGA GGA TGA AGG GAT TAT -3'；反向：5'-TTC CAA GGA CCA CTT ACA GG-3')；實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)采用SYBR Green嵌合熒光法，擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因；按照熒光定量PCR說(shuō)明書(shū) (Takara) 的反應(yīng)體系進(jìn)行，以GAPDH (正向：5'-GCA CCA CCA ACT GCT TAG C-3'；反向：5'-TCT TCT GGG TGG CAG TGA TG-3') 為內(nèi)參；反應(yīng)條件為：預(yù)變性50℃、2 min，95℃、10 min，然后95℃、15 s，56℃、45 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。

1.8 原位雜交

用地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針在腦切片檢測(cè)小鼠Sox11 RNA水平的表達(dá)。mSox11探針cDNA使用PCR引物 (正向：5'-TGG AGG GAG AAA GCT GAT GT-3'；反向：5'-TTT CAA ACC TTC CGT CTG G-3') 擴(kuò)增并克隆入pGEM-T載體。用T3及T7為正反向引物合成摻有地高辛標(biāo)記的探針。將小鼠腦放入OCT中速凍并進(jìn)行冠狀位切片 (20 μm，徠卡冰凍切片機(jī))。根據(jù)原位雜交過(guò)程進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。雜交的過(guò)程詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.9 Western blot

腦組織于蛋白裂解液 [20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1%NP-40，1% sodium deoxycholate，1 mmol/L PMSF，10 mg/ml aprotinin，1 mg/ml pepstatin A and 1 mg/ml leupeptin] 中進(jìn)行裂解。加入上樣緩沖液后在95℃變性10 min。樣品20 μl左右 (含總蛋白20 μg，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度將樣品上樣量調(diào)到相同), 與2 μl 10×上樣緩沖液混合，95℃變性10 min；將樣品和蛋白Marker依次加入上樣孔，每孔上樣體積均應(yīng)相同，空孔以1×上樣緩沖液補(bǔ)齊體積；在濃縮膠以穩(wěn)壓70 V進(jìn)行電泳，進(jìn)入分離膠后保持穩(wěn)壓110 V，直到溴酚蘭染料前沿至膠底或適當(dāng)位置；將凝膠移入電轉(zhuǎn)槽，使其處于陰極，NC 膜處于陽(yáng)極，凝膠和膜的兩側(cè)分別是濾紙及海綿，夾緊之后注入電轉(zhuǎn)緩沖液，在冰上以380 mA衡流根據(jù)目的蛋白分子量轉(zhuǎn)染適當(dāng)時(shí)間；將膜轉(zhuǎn)入用PBST (Tween20) 配制的10%脫脂奶粉溶液，室溫封閉1～4 h；用一抗4℃孵育過(guò)夜；以PBST洗膜6次，每次5 min；加入二抗孵育，室溫1 h；室溫操作，按10 ml/100 cm2加入含35 μl/10 ml BCIP和45 μl/10 ml NBT的AP Buffer，避光顯色至條帶滿意為止。

1.10 免疫熒光染色

組織冰凍切片或種植在多聚賴氨酸包被玻片上的細(xì)胞標(biāo)本，染色前用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。隨后用0.5%TritonX-100 室溫通透20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。正常羊血清工作液室溫封閉1 h。用抗體稀釋液稀釋一抗后，4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min。選擇相應(yīng)二抗，用3%牛血清白蛋白稀釋，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，最后在熒光顯微鏡下觀察照相。所使用抗體詳細(xì)信息為：抗SOX11多克隆抗體 (sc-518104，美國(guó)SANTA CRUZ公司)，抗GFP多克隆抗體 (AE012，中國(guó)ABCLONAL公司)，抗c-Myc單克隆抗體 (sc-40，美國(guó)SANTA CRUZ公司)，抗GAPDH單克隆抗體 (A19056，中國(guó)ABCLONAL公司)，山羊抗兔lgG/DylightTM 488 (ZF-0511，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 發(fā)育期小鼠大腦中Sox11表達(dá)模式

為探究Sox11的功能，我們首先明確了其在發(fā)育期小鼠大腦中的表達(dá)模式。使用Western blot (以GAPDH作為內(nèi)參) 和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Sox11基因在神經(jīng)發(fā)育中的表達(dá)。提取E (胚胎期) 12.5、E14.5、E17.5、P (產(chǎn)后期) 0、P7、P14、P21、成年小鼠 (P60) 皮層總mRNA用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示從胚胎期到成年期，Sox11基因在小鼠大腦均有表達(dá) (圖1A和B)。由E12.5至 E17.5，Sox11基因表達(dá)量逐漸增加，至E17.5達(dá)到峰值。由E17.5至P0，Sox11基因表達(dá)量逐漸下降，但表達(dá)水平仍較高。P0至P14階段，Sox11基因表達(dá)量繼續(xù)下降。P14至成年階段，Sox11基因表達(dá)量相對(duì)較低，但保持在穩(wěn)定水平。

應(yīng)用原位雜交技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)Sox11基因在胚胎期小鼠大腦有廣泛高表達(dá)信號(hào)；P0至P7階段，Sox11基因在海馬 (hippocampus, Hip)、室管膜下區(qū) (subventricular zone, SVZ) 位置有高表達(dá)信號(hào)，在大腦皮層 (cortex, CTX) 也存在表達(dá)信號(hào)。在P14，Sox11基因表達(dá)信號(hào)集中出現(xiàn)于海馬齒狀回 (dentate gyrus, DG) 和室管膜下區(qū) (圖1C)。

2.2 Sox11基因?qū)π∈蟠竽X皮層神經(jīng)元發(fā)育與遷移的影響

如圖2B所示，在 293T 細(xì)胞中進(jìn)行 LipofectamineTM2000介導(dǎo)的真核細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，采用 Western blot法，以抗c-myc單克隆抗體和抗SOX11多克隆抗體檢驗(yàn)表達(dá)蛋白。共轉(zhuǎn)小鼠Sox11-myc (mSox11-myc) 和小鼠Sox11-shRNA (mSox11 shRNA) 時(shí)，293T細(xì)胞內(nèi)小鼠Sox11基因表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明構(gòu)建的小鼠Sox11干擾載體能干擾小鼠Sox11基因的表達(dá)。但小鼠Sox11基因表達(dá)水平的降低同時(shí)能夠通過(guò)大鼠Sox11基因過(guò)表達(dá) (rSOX11-myc)，以達(dá)到其表達(dá)恢復(fù)的效果 (Rescue)。這些結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的大鼠和小鼠Sox11基因過(guò)表達(dá)載體和干擾載體可以運(yùn)用到以下的功能實(shí)驗(yàn)中。接著我們利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)，在體內(nèi)干擾小鼠Sox11基因的表達(dá)來(lái)觀測(cè)Sox11基因表達(dá)下降后小鼠神經(jīng)元遷移的改變情況。

當(dāng)mSox11 shRNA與pSUPER-GFP同時(shí)電轉(zhuǎn)入14.5 d胚胎 (E14.5) 小鼠的腦室區(qū)后，分別在 17.5 d胚胎 (E17.5)，出生當(dāng)天 (P0)，出生后4 d (P4) 和出生后7 d (P7) 觀測(cè)電轉(zhuǎn)的神經(jīng)元的遷移情況。與對(duì)照神經(jīng)元相比，轉(zhuǎn)染mSox11 shRNA的神經(jīng)元的遷移明顯延遲 (圖2A)。

Fig. 1 Expression profile of Sox11 in the developing mouse brain

在E17.5時(shí)，對(duì)照組神經(jīng)元有一部分已經(jīng)到達(dá)新皮層的表層，而大部分轉(zhuǎn)染mSox11 shRNA的神經(jīng)元仍停留在腦室區(qū)和新皮層中間區(qū)。在P0時(shí)，大部分對(duì)照組神經(jīng)元遷移至新皮層的表層，而仍有一大部分轉(zhuǎn)染mSox11 shRNA的神經(jīng)元停留在中間區(qū)。在P4時(shí)，大部分對(duì)照組神經(jīng)元遷移至新皮層的表層，而某些轉(zhuǎn)染mSox11 shRNA的神經(jīng)元僅有一部分遷移至新皮層的表層。在P7時(shí)，雖然有一部分的轉(zhuǎn)染mSox11 shRNA的神經(jīng)元最終到達(dá)了神經(jīng)板表層，但仍有大部分滯留在新皮層4～5層之間以及中間區(qū)，與對(duì)照組存在顯著差異，未能到達(dá)其最終發(fā)揮功能的位置。

使用大鼠Sox11基因過(guò)表達(dá)載體 (rSox11-myc) 對(duì)小鼠Sox11基因干擾 (mSox11 shRNA) 進(jìn)行恢復(fù) (Rescue) 后，觀測(cè)到P0時(shí)陽(yáng)性神經(jīng)元分布情況與對(duì)照組基本一致 (圖2C)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示Sox11干擾后和干擾恢復(fù)后，SVZ (subventricular zone) 區(qū)、IZ (internal zone) 區(qū)和CP (cortical plate) 區(qū)內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布具有顯著性差異 (圖2D)。以上結(jié)果提示Sox11基因影響皮層投射神經(jīng)元的遷移。

Fig. 2 Involvement of Sox11 in cortical radial migration in vivo

除此之外，與正常神經(jīng)元相比，Sox11干擾后神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的形態(tài)均顯著發(fā)生改變 (圖2E和F)。以上結(jié)果顯示正常的神經(jīng)元遷移需要Sox11在神經(jīng)前體細(xì)胞中精確的表達(dá)，以平衡其在促進(jìn)神經(jīng)分化和神經(jīng)元形態(tài)生成中的雙重功能。

3 討論

既往研究表明Sox11是精神分裂癥的易感基因，但該基因在小鼠大腦皮層神經(jīng)元遷移過(guò)程中的作用尚不清楚。本研究對(duì)Sox11在神經(jīng)元遷移過(guò)程中的功能進(jìn)行進(jìn)一步探索，將有助于對(duì)其致病機(jī)制的深入了解。

Sox11基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)存在由廣泛向局部聚集的特點(diǎn)。胚胎期，Sox11基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多數(shù)腦區(qū)皆有表達(dá)，包括大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等，提示其在神經(jīng)形成以及神經(jīng)元發(fā)育成熟過(guò)程中均發(fā)揮功能；成年后，Sox11基因表達(dá)逐漸向神經(jīng)形成區(qū)域集中，至P14該基因僅局限于海馬齒狀回和室管膜下區(qū)兩個(gè)神經(jīng)形成微環(huán)境，表明其僅在神經(jīng)形成亦或是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可塑性中發(fā)揮功效[12, 13]。

Sox11基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能研究起步較晚。在2002年，Hyodo-Miura等人首次在爪蟾模型中證實(shí)SOX11蛋白通過(guò)與MAP激酶NLK直接作用促進(jìn)神經(jīng)元分化[14]。2006年，Jankowski等人使用小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系Neuro2A和大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞模型得到SOX11基因是神經(jīng)存活和神經(jīng)突生長(zhǎng)必要因子的結(jié)論[15]。近些年來(lái)，還有大量關(guān)于SOX11基因所在SOXC家族在組織發(fā)生中的功能研究提示SOX11基因與SOX4和SOX12基因共同參與胚胎早期神經(jīng)形成[16]。

本研究首次選用Sox11基因敲低的小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)探索該基因在神經(jīng)元遷移過(guò)程中的作用。胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Sox11基因表達(dá)受干擾后，小鼠皮層投射神經(jīng)元的遷移出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致一些本應(yīng)該遷移到新皮層表層的神經(jīng)元滯留在中間區(qū)，且這種遷移障礙至小鼠P7時(shí)仍不能通過(guò)生理調(diào)節(jié)得到代償。而干擾小鼠Sox11基因的同時(shí)使用大鼠Sox11基因?qū)υ摳蓴_進(jìn)行恢復(fù)后，可以一定程度上恢復(fù)神經(jīng)元的正常遷移，說(shuō)明這種異常完全是由小鼠Sox11基因干擾造成的，即Sox11基因確實(shí)參與投射神經(jīng)元的遷移過(guò)程。我們推測(cè)，Sox11基因促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的這一功能[6]可能與其敲除后導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元遷移缺陷有關(guān)：當(dāng)Sox11基因受到干擾時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞分化延遲，SVZ區(qū)中神經(jīng)元前體減少，導(dǎo)致放射性遷移缺陷。同時(shí)，當(dāng)采用大鼠Sox11基因過(guò)表達(dá)來(lái)恢復(fù)敲低的小鼠Sox11基因時(shí)，結(jié)果顯示陽(yáng)性神經(jīng)元分布情況與對(duì)照基本一致。值得注意的是，在Sox11受干擾和干擾恢復(fù)后，SVZ區(qū)、IZ區(qū)和CP內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布具有顯著性差異。可見(jiàn)，即使在SVZ區(qū)中獲得了更多的前體，但這些前體細(xì)胞在遷移過(guò)程中大多不能形成完整的形態(tài)，最終導(dǎo)致遷移缺陷。

從神經(jīng)干細(xì)胞分化，到神經(jīng)元發(fā)育，再至神經(jīng)元遷移，這一系列步驟皆是神經(jīng)發(fā)育的重要事件。體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞存在于室管膜下區(qū)和海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層，在保持多向分化潛能和增殖性的同時(shí)，一定的神經(jīng)干細(xì)胞根據(jù)神經(jīng)發(fā)育的需要在胚胎階段非對(duì)稱分裂，產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞，這些細(xì)胞在進(jìn)一步發(fā)育的同時(shí)遷離神經(jīng)形成微環(huán)境直至到達(dá)其最終“居住”的腦區(qū)[4]。其中任何一個(gè)步驟出現(xiàn)差池，皆會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常，體內(nèi)除神經(jīng)形成早期細(xì)胞決定外，神經(jīng)元前體細(xì)胞發(fā)育各個(gè)階段皆是在神經(jīng)元遷移過(guò)程中逐步完成的。

哺乳動(dòng)物大腦皮層神經(jīng)元形成六個(gè)板層，以發(fā)育中形成的順序排列。組成這些板層的大部分神經(jīng)元是室管膜下區(qū)放射性遷移而來(lái)的。通常認(rèn)為它們的遷移是由一個(gè)放射性膠質(zhì)纖維形成的網(wǎng)絡(luò)指導(dǎo)[4]。所以，我們進(jìn)一步推測(cè)Sox11的缺失可能擾亂了該網(wǎng)絡(luò)指導(dǎo)下皮層中神經(jīng)元的排布。此外，皮層中神經(jīng)元的排布必須是嚴(yán)格有序的，這種有序性確保了皮層與海馬等腦區(qū)之間的功能連接正常。而本研究發(fā)現(xiàn)Sox11的功能缺失延遲了神經(jīng)元的遷移，這將破壞皮層中神經(jīng)元排布的有序性，進(jìn)而導(dǎo)致皮層與其他腦區(qū)之間的功能連接異常，這可能是Sox11成為精神分裂癥易感基因的原因之一。

2016年，Hoshiba等人對(duì)Sox11在皮層發(fā)育過(guò)程中起到的平衡促進(jìn)和抑制樹(shù)突形態(tài)發(fā)生的作用進(jìn)行了更細(xì)致的研究[6]。他們的結(jié)果顯示，Sox11過(guò)早的抑制導(dǎo)致了神經(jīng)元遷移的缺陷，這與我們的結(jié)果是相一致的。也有報(bào)道稱，神經(jīng)元遷移的缺陷可能與精神分裂癥[17]和雙相情感障礙的認(rèn)知功能障礙有關(guān)[9]。同時(shí)許多涉及神經(jīng)元遷移的基因相繼被證實(shí)與神經(jīng)精神疾病有關(guān)，如精神分裂癥和自閉癥等[18, 19]，本課題組之前的關(guān)聯(lián)研究也證實(shí)了Sox11是精神分裂癥的易感基因。盡管神經(jīng)元遷移和大腦皮質(zhì)發(fā)育的機(jī)制尚不清楚，但Sox11參與神經(jīng)元遷移這一關(guān)鍵性功能的揭示，表明了該基因在精神分裂癥病因?qū)W中的生理重要性。

既往研究表明，抑制Sox11表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)突的過(guò)早發(fā)育和成熟[19]。因此，我們推測(cè)Sox11也可能由于影響神經(jīng)突的分支數(shù)目，生長(zhǎng)速度，或細(xì)胞間粘附因子從而改變神經(jīng)元的遷移。本研究尚不能排除Sox11的敲低可能會(huì)影響其他神經(jīng)元遷移的因素[20]?；蛘?，若能構(gòu)建Sox11組織特異性敲除小鼠可能會(huì)有助于對(duì)該基因功能的進(jìn)一步探究。至此，Sox11影響大腦皮層神經(jīng)元遷移的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和探索。未來(lái)結(jié)合臨床，一部分與精神分裂癥關(guān)聯(lián)的Sox11基因的陽(yáng)性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)如何通過(guò)影響Sox11基因的表達(dá)，從而參與精神分裂癥發(fā)生發(fā)展等機(jī)制值得被我們進(jìn)一步予以關(guān)注和研究。