陳瑜毅 韓蘊(yùn)麗 李 杏 黃詩(shī)琴

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（廣西南寧 530021）；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院（廣西南寧 530003）

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，導(dǎo)致肌肉無(wú)力和萎縮。臨床表現(xiàn)為累及肢體近端的進(jìn)行性、對(duì)稱(chēng)性的弛緩性癱瘓與肌萎縮?；町a(chǎn)嬰兒中SMA 的發(fā)生率是1/10000～1/6000，人群攜帶率為1/50[1]，國(guó)內(nèi)人群攜帶率約為1/42[2]。本文對(duì)31例SMA 患兒的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，總結(jié)SMA 的臨床和基因診斷，探討SMN基因與臨床表型的關(guān)系，以提高對(duì)SMA的認(rèn)識(shí)，為臨床干預(yù)和遺傳咨詢(xún)提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014 年2 月至2019 年5 月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷的31例SMA患兒及其父母的臨床資料以及基因分析結(jié)果。研究對(duì)象排除其他以肌無(wú)力為特征的相關(guān)疾病，包括各種類(lèi)型的肌營(yíng)養(yǎng)不良性疾病、腦性癱瘓遲緩型、先天性重癥肌無(wú)力、先天性肌病、線粒體肌病、遺傳性感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、脊髓延髓肌萎縮癥等疾病以及臨床資料不完整，未完善神經(jīng)電生理檢查及基因檢測(cè)者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

收集患兒的起病年齡、性別、肌力、肌張力、運(yùn)動(dòng)里程碑發(fā)育等臨床資料，總結(jié)臨床及基因分析 結(jié)果。

1.2.2 遺傳學(xué)檢查

分別采集患兒及父母的外周靜脈血各2 mL 行EDTA 抗凝處理。用QIAmp DNA Blood Mini Kit 提取基因組DNA，分離純化、洗脫收集DNA，提取的DNA 片段進(jìn)行分子量、濃度和純度等檢測(cè)。為避免DNA 分解先進(jìn)行分裝，置-20℃保存。采用多重連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照SALSA MLPA probemix p060-B2 SMA試劑盒（荷蘭 MRC-Holland 公司）說(shuō)明進(jìn)行DNA 標(biāo)本變性、雜交、連接、PCR擴(kuò)增、片段分離。應(yīng)用Coffalyser.NET軟件（MRC-Holland，www.mlpa.com-MLPA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，Ratio值為0時(shí)表明沒(méi)有拷貝數(shù)，為純合缺失；Ratio值為0.40～0.65時(shí)拷貝數(shù)為1，為雜合缺失；Ratio值為0.80～1.20時(shí)拷貝數(shù)為2，表示正常；Ratio值為1.30～1.65時(shí)拷貝數(shù)為3；Ratio值為1.75～2.15時(shí)拷貝數(shù)為4；Ratio值多于2個(gè)拷貝數(shù)的即為重復(fù)。

1.2.3 SMA分型

入選研究對(duì)象按2006 年世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟神經(jīng)肌肉疾病研究組制訂的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo) 準(zhǔn)[3]，主要依據(jù)起病年齡、病情進(jìn)展情況及運(yùn)動(dòng)發(fā)育里程碑分為4 種主要常見(jiàn)類(lèi)型。脊髓性肌萎縮癥1型(Werdnig-Hoffman 病)，嬰兒型或嚴(yán)重型，一般在生后6個(gè)月內(nèi)起病，生后即出現(xiàn)活動(dòng)少，肌張力低，抬頭不穩(wěn)，可有宮內(nèi)胎動(dòng)減少史，通常在2 歲前死亡，是最嚴(yán)重的類(lèi)型；脊髓性肌萎縮癥2型（Dubowitz 病），為中間型，生后6～18 個(gè)月起病，患兒能獨(dú)坐，但不能獨(dú)立行走，可有關(guān)節(jié)攣縮和脊柱后凸，生存期一般在2 年以上，多數(shù)可活到成年；脊髓性肌萎縮癥3型(Kugelberg-Welander病)，為青少年型，多于生后18個(gè)月起病，能夠獨(dú)立行走，隨著病情緩慢進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)肌無(wú)力癥狀，可伴有骨質(zhì)疏松和脊柱側(cè)彎，生存期可至成年；脊髓性肌萎縮癥4型，晚發(fā)型，亦稱(chēng)成年型，通常在30歲或更晚起病，起病與進(jìn)展較隱匿，是最輕的一種類(lèi)型，運(yùn)動(dòng)功能可以達(dá)到終身正常行走且生存期與正常人無(wú)異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

31例SMA患兒中，男性20例、女性11例，男女比例1.8:1。6月齡內(nèi)起病12例，占38.7%，年齡中位數(shù)為2.5個(gè)月；7～18月齡起病17例，占54.8%（17/31），年齡中位數(shù)為9 個(gè)月；18 月齡后起病2例，占6.5%，年齡中位數(shù)為48個(gè)月。1型SMA 12例（38.7%），2型17例（54.8%），3型2例（6.5%）。

患兒首發(fā)癥狀均為運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，13例（41.9%）肌張力低下，9例（29.0%）肌力下降，5例（16.1%）步態(tài)異常，4例（12.9%）生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。以近端肢體出現(xiàn)肌無(wú)力為主，下肢較上肢嚴(yán)重，腱反射減弱或消失；患兒均無(wú)感覺(jué)和認(rèn)知變化。31例SMA 患兒的臨床資料見(jiàn)表1。

表1 31例SMA患兒臨床資料

2.2 各型SMA患兒SMN1基因第7和/或8外顯子缺失情況

31例臨床診斷SMA患兒中，SMN1第7和8外顯子純合缺失29例，占93.5%，包括1型12例，2型15例，3型2例；僅有第7外顯子缺失者2例，占6.5%（2/31），均為2型SMA。不同類(lèi)型SMA 的臨床表型與SMN 1基因缺失類(lèi)型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.415）。見(jiàn) 表2。

2.3 各型SMA患兒SMN2基因拷貝數(shù)變化情況

SMN 2基因拷貝數(shù)2 為12例（38.7%），其中1型SMA 10例（83.3%），2型SMA 2例（16.7%）；拷貝數(shù)3 或4（重復(fù)）為19例（61.3%），其中1型SMA 2例（10.5%），2型SMA 15例（79.0%），3型SMA 2例（10.5%）。本組患兒中，2型和3型SMA患兒的SMN2基因拷貝數(shù)顯著高于1型SMA 患兒，3型SMA 患兒的SMN 2基因拷貝數(shù)明顯高于2型SMA 患兒，不同SMA 臨床表型與SMN 2拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 SMA患兒父母親SMN1、SMN2基因拷貝數(shù)情況

30例（96.8%）患兒的父母親均明確診斷為SMN 1基因雜合缺失；1例（3.2%）患兒父親明確診斷為SMN 1雜合缺失，母親SMN 1基因未檢測(cè)到純合或雜合缺失。即有61例（98.4%）雙親攜帶1個(gè)SMN 1基因拷貝數(shù)，提示為SMA 致病基因攜帶者。包括SMN 1缺失（SMN 1:SMN 2=1:1，16例；SMN 1:SMN 2=1:2，20例）產(chǎn)生的攜帶者36例，占59.1%；SMN1轉(zhuǎn)換為SMN2（SMN1:SMN2=1:3，13例；SMN 1:SMN 2=1:4，12例）產(chǎn)生的攜帶者25例，占40.9%。1例（1.6%）患兒母親攜帶2 個(gè)SMN 1和SMN2基因拷貝數(shù)。見(jiàn)表4。

3 討論

根據(jù)2006 年世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟神經(jīng)肌肉疾病研究組制訂的SMA 診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)[3]，依據(jù)起病年齡、病情進(jìn)展情況及運(yùn)動(dòng)發(fā)育里程碑，可將SMA分為4型，分別為SMA-1型、SMA-2型、SMA-3型、SMA-4型。因SMA-4型在成人期起病，根據(jù)年齡劃分，兒童時(shí)期SMA主要為SMA-1型（嬰兒型）、SMA-2型（中間型）及SMA-3型（青少年型）。在臨床上，各型SMA 嚴(yán)重程度差別大，起病年齡可從新生兒期至成人期，運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙從不能抬頭至可獨(dú)立行走，存活期可到嬰幼兒至成年不等。本組31例SMA 患兒中，SMA-1型12例(38.7%)，2型SMA 17例(54.8%)，3型SMA 2例(6.5%)。首發(fā)癥狀包括肌張力低下、肌力下降、步態(tài)異常、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等。各類(lèi)型間在首發(fā)臨床表現(xiàn)中有重疊現(xiàn)象，因此在臨床分型中，還需觀察有無(wú)其他臨床表現(xiàn)以及在病情進(jìn)展過(guò)程中患兒運(yùn)動(dòng)功能獲得情況作為分型依據(jù)。

近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)研究迅速發(fā)展，SMA患兒可以通過(guò)基因檢測(cè)得到明確診斷。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活1基因（survival motor neuronal gene 1,SMN1）于1995 年由法國(guó)學(xué)者Lefebvre 等[4]首次克隆成功，定位于5 q 11.2-13.3 區(qū)域內(nèi)，該基因缺失是脊髓性肌萎縮癥的致病基礎(chǔ)，其突變導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白（survival motor neuron，SMN）表達(dá)水平降低或功能喪失。體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞都能耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不能耐受低水平SMN 蛋白，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[5]。人類(lèi)SMN基因有兩個(gè)高度同源的拷貝，即SMN1和SMN2；兩者具有5個(gè)核苷酸的差異，但在編碼區(qū)僅有1個(gè)核苷酸的差異（c.840C>T），導(dǎo)致SMN 2基因轉(zhuǎn)錄剪切中發(fā)生跳躍，其缺少外顯子7 編碼的核心功能區(qū)，只表達(dá)為全長(zhǎng)SMN蛋白（FL-SMN）的10%～20%，且大部分編碼1個(gè)不具生物功能、極不穩(wěn)定且易分解的截短蛋白（?7-SMN）[6]。因此，SMN2基因只有在SMN1基因缺失情況下才起到劑量補(bǔ)償?shù)淖饔谩?/p>

在國(guó)內(nèi)人群中，約95%的SMA 患兒存在SMN 1基因第7外顯子和/或第8外顯子的純合缺失[7]，且大多數(shù)同時(shí)缺失外顯子7和外顯子8，只有少部分患兒僅缺失外顯子7。本研究采用MLPA技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)。SMN1外顯子7和8純合缺失者有29例，占93.5%，包括1型SMA 12例（41.4%），2型SMA 15例（51.7%），3型SMA 2例（6.9%）；僅外顯子7 缺失者有2例（全部為2型SMA），占6.5%。本組SMA患兒中未發(fā)現(xiàn)只有外顯子8缺失的病例。其原因?yàn)镾MN基因的終止密碼子位于外顯子7 的末端附近，外顯子8 并不編碼氨基酸。SMA患兒正是由于外顯子7編碼的核心功能區(qū)缺失和SMN 1基因重要功能喪失所致。本研究表明，不同SMA 臨床表型與SMN 1基因缺失類(lèi)型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，SMN 1基因缺失的測(cè)定在各型SMA患兒中具有相同的臨床價(jià)值。該結(jié)論與Fang等[8]的報(bào)道一致。

本研究中，2型和3型SMA 患兒的SMN 2基因拷貝數(shù)顯著高于1型患兒，3型SMA 患兒SMN 2基因拷貝數(shù)明顯高于2型患兒，表明不同SMA 臨床表型與SMN 2拷貝數(shù)有顯著差異，提示SMN 2基因拷貝數(shù)與疾病的臨床表型嚴(yán)重程度相關(guān)。SMN 2基因通常被認(rèn)為是脊髓性肌萎縮的修飾基因。當(dāng)SMN1基因缺失時(shí)，SMN 2基因通過(guò)轉(zhuǎn)換部分補(bǔ)償了表達(dá)全長(zhǎng)SMN 蛋白的功能。該結(jié)果與Qu等[9]報(bào)道一致。另外，相同拷貝數(shù)的SMN 2基因可存在于各類(lèi)型的SMA 患兒中。本研究中SMN2基因拷貝數(shù)2為12例，其中1型SMA 10例，2型SMA 2例；拷貝數(shù)3或4（重復(fù)）為19例，其中1型SMA 2例，2型SMA 15例，3型SMA 2例。因此，雖然SMN2基因的拷貝數(shù)可解釋大多數(shù)SMA的表型變化，但應(yīng)該注意的是，SMN 2基因的拷貝數(shù)并不能完全預(yù)測(cè)表型的嚴(yán)重程度[10]。這是因?yàn)樵赟MA患兒中還有其他的修飾基因，如神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP）基因、基本轉(zhuǎn)錄因子2p44 (basal transcription factor 2p44,BTF2p44)基因和H4F5基因。另外在王旻晉等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，SMN 2在3型SMA 中有更多的拷貝數(shù)5 或6。本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)更多的SMN2拷貝數(shù)，考慮與樣本數(shù)量少有關(guān)。

另一項(xiàng)研究顯示，約5%的SMA患兒存在SMN1基因復(fù)合雜合突變[12]，即存在一個(gè)SMN 1基因缺失，并伴有另一個(gè)SMN 1基因內(nèi)的點(diǎn)突變。如果患兒臨床表型與SMA 一致，但未能檢測(cè)出SMN 1第7 外顯子純合缺失，有必要再次進(jìn)行臨床評(píng)估，另外應(yīng)考慮存在SMN1基因點(diǎn)突變的可能性，并需進(jìn)一步的基因測(cè)序證實(shí)，從而確定是否為復(fù)合雜合突變的SMA 患兒。2個(gè)SMN1基因均發(fā)生點(diǎn)突變者極少，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道[10]。本研究中31例SMA患兒經(jīng)MLPA檢測(cè)均為純合缺失，未發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變。這與納入的病例數(shù)少 有關(guān)。

本研究中有30例（96.8%）患兒父母親明確為SMN 1基因雜合缺失，1例（3.2%）患兒父親明確診斷為SMN 1雜合缺失，母親SMN 1基因未檢測(cè)到純合缺失或雜合缺失。即有98.4%的父/母親攜帶1個(gè)拷貝數(shù)的SMN 1基因，表明他們均為SMA 致病基因攜帶者，其中SMN 1缺失（SMN 1:SMN 2=1:1 和SMN 1:SMN 2=1:2）引起的占59.1%，SMN 1轉(zhuǎn)換為SMN 2（SMN 1:SMN 2=1:3 和SMN 1:SMN 2=1:4）引起的占40.9%。1例（1.6%）患兒母親攜帶2 個(gè)拷貝數(shù)的SMN 1基因。推測(cè)可能是SMN 1基因“2+0”型（即含2 個(gè)拷貝數(shù)的SMN 1基因位于同一條染色體上，另一條同源染色體缺失SMN 1基因）、“1+1 D”型（即含1 個(gè)拷貝數(shù)的SMN 1基因位于一條染色體上，另一條同源染色體發(fā)生點(diǎn)突變）或無(wú)義突變等所致。龔波等[13]發(fā)現(xiàn)SMA 攜帶者中有1 個(gè)拷貝數(shù)的SMN 1和0 個(gè)拷貝數(shù)的SMN 2個(gè)體。但在本研究中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該比值的攜帶者，考慮與研究病例數(shù)少 有關(guān)。

本研究?jī)H應(yīng)用MLPA技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)，該方法未能檢測(cè)到上述突變。這也需要通過(guò)進(jìn)一步連鎖分析或基因測(cè)序來(lái)確認(rèn)。應(yīng)該對(duì)此類(lèi)父母進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)。因此產(chǎn)前診斷是減少SMA 患兒出生、降低SMA發(fā)生率的一種手段，是減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)最有效的途徑[14]。在部分國(guó)家中，SMA檢測(cè)方法已被納入孕前篩查[15-17]，特別是對(duì)防止先證者家庭再次生育SMA子女具有重要意義。

本研究受檢測(cè)條件限制，未對(duì)除SMN2以外的修飾基因及可能發(fā)生SMN1復(fù)合雜合變異類(lèi)型進(jìn)行更深入研究，有待今后聯(lián)合其他檢測(cè)方法進(jìn)一步研究。