王桂喜 孫 錕 孔令暉 邱吉?jiǎng)?王 鑒 鐘士慶 李華鋒 孟 卓 黃玉強(qiáng)

1.臨沂市婦幼保健院（山東臨沂 276000）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是胎兒期心臟及大血管發(fā)育異常所致的先天性畸形，是最常見的出生缺陷之一，也是近年來導(dǎo)致胎兒出生缺陷的首位因素。文獻(xiàn)報(bào)道，存活嬰兒中CHD 的發(fā)生率為0.6%～1.3%[1]。復(fù)雜CHD 是導(dǎo)致新生兒、兒童死亡或殘疾的主要原因之一，嚴(yán)重影響出生人口的質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有150～200萬CHD 患兒出生，我國每年約15 萬CHD 新生兒出生。研究提示，CHD 的發(fā)生與染色體異常有關(guān)[2]。研究表明8%～13%的CHD 伴有染色體變異，尤其是染色體非整倍體改變，如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等[3]。除此之外，染色體微缺失/微重復(fù)綜合征也是引起CHD 的重要原因之一，最為經(jīng)典的是22 q 11.2 微缺失綜合征和Williams綜合征（7q11.23微缺失），因此對(duì)CHD患兒行相關(guān)致病基因診斷尤為重要。傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法依賴于細(xì)胞遺傳學(xué)染色體G顯帶核型分析及熒光原位雜交技術(shù)（FISH），但由于操作復(fù)雜、分辨率低、周期長(zhǎng)等，2013 年美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)和母胎醫(yī)學(xué)會(huì)建議，對(duì)于產(chǎn)前超聲證實(shí)胎兒伴一個(gè)或多個(gè)重大結(jié)構(gòu)異常時(shí)，可采用染色體微陣列分析（CMA）檢測(cè)[4]。CMA技術(shù)根據(jù)芯片設(shè)計(jì)和檢測(cè)原理分為兩種：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性微陣列（SNP array）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術(shù)。本研究旨在探討SNP array分析技術(shù)在胎兒CHD診斷中的 價(jià)值。

1 臨床資料

選擇2017年1月到2020年12月，因胎兒CHD和/ 或超聲軟指標(biāo)（ultrasound soft indicators）陽性再行產(chǎn)前診斷的孕婦及胎兒200 對(duì)（其中臨沂市婦幼保健院184例，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院16例）。200例孕婦均行羊膜腔穿刺。孕婦年齡18～40歲，平均（29.4±4.1）歲；孕周17.5～28.4周，平均（22.6±2.1）周。產(chǎn)前超聲檢查200例胎兒中，孤立性室間隔缺損60例，孤立性左室強(qiáng)光點(diǎn)38例，房間隔缺損22例，法洛四聯(lián)癥14例，永存左上腔11例，左/右心發(fā)育不良5例，其他心臟結(jié)構(gòu)異常50例。

經(jīng)超聲檢查提示胎兒為先天性心臟病后，予胎兒父母遺傳咨詢，父母同意行產(chǎn)前診斷，并簽訂知情同意書。在無菌條件下抽取羊水，離心收集羊水細(xì)胞，采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)10～14天，細(xì)胞生長(zhǎng)良好下加入秋水仙堿，收集羊水細(xì)胞，常規(guī)制片，G 顯帶，每例鏡下觀察30個(gè)細(xì)胞的分裂相，分析羊水細(xì)胞染色體核型。如疑為異常核型或嵌合型，則計(jì)數(shù)不少于50個(gè)分裂相。200例孕婦羊水的染色體核型分析檢出1例18-三體綜合征，為室間隔缺損合并單臍動(dòng)脈；其余樣本核型分析均正常。

羊水SNP array檢測(cè)應(yīng)用CytoScan750k芯片試劑盒（Affymetrix，USA），包含約75萬個(gè)拷貝數(shù)探針，約20萬個(gè)SNPs 探針，覆蓋已知癌基因。應(yīng)用Affymetrix基因芯片平臺(tái)相配套的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，并與相關(guān)數(shù)據(jù)庫對(duì)比。結(jié)果判定：根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)將拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）分為①良性CNVs；②臨床意義不明確的CNVs (variants of unknown significance，VOUS)；③致病性CNVs。200例胎兒中檢出22例CNVs，其中11例為致病性CNVs。在11例致病性CNVs中，Williams-Beuren綜合征2例、Wolf-Hirschhorn綜合征2例、22 q 11.2 微重復(fù)綜合征1例，以及6例Decipher 數(shù)據(jù)庫中包含片段和/或包含導(dǎo)致CHD 的致病基因；剩余11例為臨床意義不明確的CNVs。染色體核型為18-三體綜合征的胎兒SNP 分析結(jié)果為arr[hg19]18p11.32q23（136,227-78,013,728）x3，且為致病性。見表1。

表1 SNP分析結(jié)果

2 討論

CHD 是較為常見的出生缺陷，發(fā)生率居高不下。近年來研究發(fā)現(xiàn)CHD與染色體異常有關(guān)，故越來越多的產(chǎn)前診斷應(yīng)用于臨床。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法包括染色體G顯帶核型分析及熒光原位雜交技術(shù)，但由于其分辨率低、周期長(zhǎng)及通量低等缺點(diǎn)，2013 年美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)和母胎醫(yī)學(xué)會(huì)建議，對(duì)于常規(guī)不伴胎兒結(jié)構(gòu)異常但行侵入性產(chǎn)前診斷者，可行G 顯帶核型分析，也可行染色體微陣列檢測(cè)；對(duì)于產(chǎn)前超聲證實(shí)胎兒伴有結(jié)構(gòu)異常時(shí)推薦用染色體微陣列檢查代替?zhèn)鹘y(tǒng)的G顯帶核型分析[4]。

本研究采用核型加SNP array 分析檢查，普通染色體核型僅檢出1例為18-三體綜合征，檢出率為0.5%，低于以往研究[5]，可能與本組胎兒大多為簡(jiǎn)單型CHD有關(guān)。聯(lián)合SNP array分析后檢出22例CNVs異常，其中11例為致病性，檢出率與報(bào)道相符[6]，11例為臨床意義不明確，與以往研究結(jié)果吻合[7]。本研究200例病例中，經(jīng)隨訪，22例CNVs 異常者均已引產(chǎn)。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果提示VOUS 時(shí)，雖然致病性不明確，但仍可能是致病原因，故需排除家族性良性變異，并給予合理的遺傳咨詢。本研究中因經(jīng)濟(jì)條件原因，家屬未行SNP array分析檢測(cè)。本組胎兒中，病例1為室間隔缺損，SNP 結(jié)果提示其22 號(hào)染色體q 11.21 區(qū)域異常。已知22 q 11.2 微缺失綜合征是目前研究比較透徹的一種染色體結(jié)構(gòu)異常所致的綜合征，由22 號(hào)染色體長(zhǎng)臂近著絲粒端微片段22 q 11.21-q 11.23 缺失引起，也是人類最常見的染色體微缺失綜合征。大約74%的22 q 11.2 微缺失綜合征患兒有CHD，其中以法洛四聯(lián)癥、主動(dòng)脈弓中斷、室間隔缺損和永存動(dòng)脈干為多見[8]。Williams-Beuren綜合征是一種由染色體7q11.23區(qū)域微缺失導(dǎo)致的累及多系統(tǒng)的罕見病，缺失一般介于1.5～1.8 Mb之間，累及26～28個(gè)基因，主要臨床表現(xiàn)為特殊面容、先天性心血管畸形（最常見為主動(dòng)脈瓣上狹窄）及內(nèi)分泌系統(tǒng)異常等。本研究SNP array 檢出2例Williams-Beuren綜合征，臨床表現(xiàn)為永存左上腔、主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈狹窄，與以往報(bào)道 相符[9]。

相比傳統(tǒng)染色體核型而言，染色體微陣列技術(shù)具有高分辨、高通量和高準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)，可以作為傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳分析方法的有益補(bǔ)充應(yīng)用于臨床細(xì)胞遺傳診斷中。但仍有不足，比如其檢測(cè)出的CNVs 臨床意義不明確的小片段，給遺傳咨詢帶來不便。本研究檢測(cè)出11例臨床意義不明的CNVs。另外基因芯片不能檢測(cè)出平衡易位和倒位，可能會(huì)出現(xiàn)漏診。因此，在應(yīng)用基因芯片的同時(shí)，應(yīng)提供適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢，包括檢測(cè)結(jié)果的解釋及實(shí)驗(yàn)室所存在的局限性說明，另外由于家屬不想提供新生兒預(yù)后，導(dǎo)致剩余的178例病例未進(jìn)行 隨訪。

綜上所述，本研究提示CHD 發(fā)生與染色體異常有關(guān)，普通染色體核型檢查檢出率低，SNP array 分析技術(shù)顯著提高了染色體異常的檢出率，對(duì)于尋找CHD的病因具有指導(dǎo)意義。故為降低出生缺陷的發(fā)生率，選擇合理的產(chǎn)前診斷方法及優(yōu)質(zhì)的遺傳咨詢尤為 重要。