丁劉慧子 邳 植 吳則東

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

隨著DNA分子標記技術(shù)快速發(fā)展，農(nóng)作物品種鑒定進入了基因水平[6]。較為常見的分子標記技術(shù)有 RFLP[7]、RAPD[8]、AFLP[9]、EST[10]、ISSR[11]、SSR[12]、SRAP[13]及 SNP[14]等。SSR，即微衛(wèi)星序列，是在真核生物中普遍存在的一段由1～6bp組成的重復(fù)序列，大約每10～50kb就存在1個微衛(wèi)星[6]，且跨外顯子和內(nèi)含子，具有擴增多態(tài)性好、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于作物品種鑒定、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。目前，玉米[15]、小麥[16]、馬鈴薯[17]和菜豆[18]等作物都已經(jīng)利用SSR標記技術(shù)構(gòu)建了指紋圖譜。

近年來，甜菜分子標記發(fā)展較快[19]，已有研究[20]表明，優(yōu)化甜菜SSR標記的鑒定體系，開發(fā)和篩選出甜菜專有的SSR引物成為甜菜品種鑒定的關(guān)鍵。本研究在前人研究的甜菜SSR分子標記基礎(chǔ)上，開發(fā)了多對甜菜專用SSR引物，對2017年國家實行品種登記以來至2019年登記的107個甜菜品種進行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，對參試甜菜品種進行鑒定，為鑒定甜菜種子市場銷售中品種的純度和真?zhèn)涡蕴峁┮罁?jù)。同時對SSR引物進行多樣性評價，篩選出具有高多態(tài)性的SSR引物，為甜菜品種鑒定等生物技術(shù)方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以目前我國市場上已經(jīng)登記的107個甜菜品種為材料進行指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。品種詳情見表1。

表1 供試甜菜品種及來源Table 1 Tested sugar beet varieties and sources

續(xù)表1 Table 1 (continued)

1.2 SSR引物

20對SSR標記引物序列來自黑龍江大學(xué)甜菜遺傳改良育種重點實驗室以及相關(guān)文獻，或通過EST序列獲得[21-23]（表2）。SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用HAP方式純化。

表2 SSR引物信息Table 2 SSR primers information

1.3 基因組DNA的提取、純化與檢測

參試品種在黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)試驗地種植，試驗地為地勢平坦的黑土地，pH 6.5。該地屬于中溫帶大陸性季風氣候，全年活動積溫≥2700℃，年均氣溫約6.1℃，年均日照約2555.7h，無霜期約150d。試驗于2020年4月進行。機械開溝，人工播種，每個品種種植2行，行長10m，壟寬0.67m，株距20cm，播深約3cm。每個品種2次重復(fù)。在甜菜嫩葉時期，每個品種摘取10個單株幼葉進行混剪，采用 CTAB法[24]提取全基因組DNA。利用NanoDrop 2000/2000c超微量紫外可見分光光度計（Thermo公司）測定提取的DNA濃度和純度，以O(shè)D260/OD280值為1.8～2.0作參照，不符合標準的樣本重新提純。將最終獲得的符合試驗要求的107個甜菜DNA樣品稀釋成10ng/μL的工作液，并置于-20℃冰箱備用。

1.4 PCR擴增

使用Veriti 96-Well Theraml Cycler PCR儀進行PCR擴增，反應(yīng)體系5.0μL：DNA模板1.0μL，百泰克公司 2×TaqPCR Master Mix 2.0μL，水 1.0μL，上游和下游引物各0.5μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4min；94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。

1.5 電泳檢測

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，電泳儀為Bio-Rad PowerPac 200。每孔點樣 2μL，緩沖液 0.5×TBE，恒壓 180V，電泳90min。電泳結(jié)束后，使用硝酸銀法進行凝膠染色，將膠放入染色液中（180mL蒸餾水、20mL無水乙醇、0.4g硝酸銀）5min，然后取出放入裝有100mL蒸餾水的塑料盆中漂洗 60s，最后放入顯影液（200mL蒸餾水、6g氫氧化鈉和1mL甲醛）中，直至出現(xiàn)清晰條帶，立即拍攝圖像保存。

5.1 種公雞要精選，保證精液質(zhì)量，并定期檢測公雞精液質(zhì)量，及時淘汰不合格種公雞，保證種蛋受精率，降低飼養(yǎng)成本。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個樣品的SSR擴增條帶以0和1記錄，在相同的遷移率位置上，有帶記為 1，無帶記為 0，構(gòu)建0、1數(shù)字指紋圖譜。SSR標記位點的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC），按公式計算，其中Pi為i位點基因出現(xiàn)的頻率。利用 PopGene軟件對20對SSR引物的PCR產(chǎn)物進行多樣性分析，計算各SSR引物的等位基因數(shù)（allele number，Na）、有效等位基因數(shù)（number of effective allele，Ne）、Shannon’s多樣性指數(shù)（Shannon’s information index，I）和Nei’s指數(shù)（H）。利用 MEGA 7.0 軟件計算品種間遺傳距離，根據(jù)結(jié)果采用類平均法（UPGMA）進行聚類分析，繪制品種間親緣關(guān)系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)字指紋圖譜構(gòu)建

將 PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測可以得到清晰的條帶圖。記錄20對引物對107個甜菜品種擴增出的條帶圖，以此構(gòu)建由20對引物對107個參試甜菜品種的0、1數(shù)字指紋圖譜（全數(shù)字圖譜略）。

以引物TC122擴增產(chǎn)物為例，約在500bp位置，1～48號甜菜品種擴增情況為 00001001100111 0100010110000100010100100000100000（圖 1）。

圖1 1～48號甜菜品種的TC122引物PCR擴增圖譜Fig.1 PCR products fingerprintings of sugar beet varieties using primer TC122

2.2 SSR引物多態(tài)性

多樣性分析結(jié)果（表3）顯示，20對SSR標記共檢測獲得等位基因112個，變幅為2～9個，平均每對檢測到5.6個，其中標記BVV45檢測到的位點數(shù)最高為9，標記LNX21、LNX87、SSD81檢測到的位點數(shù)最低為4。多態(tài)百分比在50.00%～100.00%，標記 LNX37最低，為 50.00%，標記 BVV21、FDSB1427、LNX87、LNX88、SSD81和 TC81最高，均為100.00%。20對SSR標記Na介于4～14之間；有效等位基因數(shù)Ne為 2.97～10.14；PIC值為0.08～0.83。其中BVV21、SB13和TC97的PIC值均≥0.75，具有高多態(tài)信息含量。H介于0.39～1.87之間，其中LNX63、TC97和TC122均＞1.50；I變異范圍 0.78～2.90，LNX63、SB13、TC81、TC97、TC122均≥2.00，具有較高的群體遺傳度。表明107個甜菜品種間變異范圍較大，具有較為豐富的遺傳多樣性。

表3 供試材料SSR引物多態(tài)性信息Table 3 Polymorphism information of SSR primers in the tested materials

綜合以上多態(tài)性指標來看，SSD130、SB13、TC81、TC97和TC122多態(tài)性較高，可作為甜菜品種鑒定的核心引物。其中TC81、TC97和TC122均為黑龍江大學(xué)甜菜遺傳改良育種重點實驗室開發(fā)的甜菜專用的SSR引物。

2.3 遺傳距離及聚類分析

利用MEGA 7.0計算品種間遺傳距離。圖2顯示，107個甜菜品種間最大遺傳距離為0.467，最小為0.065，平均遺傳距離為0.298。其中品種SD13829與HI1003、BTS8125與SR496、HX910和BTS8126、HX910與BTS8125、MA2070與KWS4502、MA097與金谷糖BETA218均為不同育種來源的甜菜品種，而品種 HX910和 SV2085均為荷蘭 SES Vander Have品種，這 7對品種的遺傳距離最遠；品種KUHN1260與KUHN1357遺傳距離最近，來源均為荷蘭 SES Vander Have。聚類結(jié)果基本符合同一育種來源的甜菜品種遺傳背景較相似的規(guī)律。

基于指紋圖譜進行聚類分析（圖2）。遺傳距離在0.16時，可將107個甜菜品種分為2個類群。類群Ⅰ包括29個品種，類群Ⅱ包括78個品種。類群Ⅰ、Ⅱ又可分多個亞群。類群 I在遺傳距離 0.14時，可分為2個亞群（Ⅰ-1、Ⅰ-2），亞群Ⅰ-1又可分為亞群Ⅰ-1-1和Ⅰ-1-2。亞群Ⅰ-1-1共 12個品種，其中22號KWS2314和25號BTS8840品種間遺傳距離最近。亞群Ⅰ-1-2中，8號KWS3928和11號金谷糖BETA218遺傳距離最近。類群Ⅱ在遺傳距離0.14時可分為2個亞群（Ⅱ-1、Ⅱ-2）。亞群Ⅱ-1共13個品種，其中遺傳距離最近的為73號MA3005和74號MA10-4。亞群Ⅱ-2共65個品種，其中102號KUHN1260與103號KUHN1357品種間遺傳距離最近。

圖2 107個甜菜品種的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 107 sugar beet varieties

在亞群Ⅰ-1-1的12個品種中23～27號均來自美國BETASEED公司；28～30號來自中國新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所；22、31、33和34號均來自德國KWS SAAT SE。在亞群Ⅰ-1-2中的品種也均來自這3個育種單位。說明這三者的甜菜品種的遺傳背景具有相對較高的相似度。亞群Ⅰ-2-1中的12～15號甜菜均來自丹麥Maribohillesh?g ApS。所以從類群Ⅰ的甜菜品種分類中，可以得出美國BETASEED公司、中國新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所、德國KWS SAAT SE、荷蘭SES Vander Have和丹麥Maribohillesh?g ApS 5個種子單位的甜菜品種具有較高的相似性，而且基本符合同一育種來源的品種具有較高遺傳背景相似度的規(guī)律。

在亞群Ⅱ-1的13個品種中64～70和72號品種來自荷蘭 SES Vander Have，73～76號來自丹麥Maribohillesh?g ApS，僅有77號來自于中國黑龍江北方種業(yè)有限公司，這也進一步驗證了之前得到的結(jié)論。

3 討論

目前國內(nèi)已有利用 ISSR[25]、SSR[26]以及SRAP[13]等分子標記構(gòu)建國內(nèi)外甜菜品種指紋圖譜的報道，但所用的品種都較少，如劉蕊等[12]使用18個INDEL和SSR引物對21個甜菜品種進行遺傳圖譜的構(gòu)建和聚類分析；王華忠等[27]利用SRAP和SSR分子標記技術(shù)對49個不同類型的甜菜進行了遺傳多樣性分析。SSR標記具有共顯性、重復(fù)性好、高分辨率、多態(tài)性高和操作相對簡單等優(yōu)點[28]，在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、物種進化、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。這說明SSR標記在甜菜品種應(yīng)用方面具有潛在價值，但是與其他作物相比仍然屬于初級階段。與大田作物相比，應(yīng)用SSR標記分析甜菜遺傳多樣性的研究遠遠落后，國內(nèi)外鮮有利用SSR標記進行甜菜遺傳相關(guān)研究的報道。究其原因，SSR分子標記的開發(fā)具有一定的難度，成本較高；近年來，雖然甜菜種植面積有所上升，但仍屬于小作物。因此甜菜的種子市場被國外品種占據(jù)，品種鑒定的研究就更少，這不利于對國內(nèi)甜菜的品種保護和育種研究。由于我國非甜菜起源地，且甜菜起源單一，甜菜種質(zhì)資源匱乏，同一優(yōu)良不育系或者授粉系會在不同的品種中反復(fù)使用，造成甜菜品種遺傳基礎(chǔ)狹窄[29]。從本試驗結(jié)果來看，各甜菜品種的遺傳距離在0.065～0.467之間，這也在分子水平進一步證明了甜菜遺傳基礎(chǔ)狹窄。世界范圍內(nèi)的各大育種公司育成的甜菜品種也具有遺傳距離較近的特點。結(jié)果得出，同一育種單位的品種具有更高的遺傳相似性，美國BETASEED公司、中國新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所、德國KWS SAAT SE、荷蘭SES Vander Have和丹麥Maribohillesh?g ApS 5個種子單位的甜菜品種具有較高的相似性。

目前國內(nèi)甜菜品種鑒定的進展較為緩慢，一方面是由于甜菜品種自身遺傳性質(zhì)的限制，另一方面，甜菜的經(jīng)濟現(xiàn)狀（產(chǎn)量、生物量、抗逆性）由多個基因共同決定，并且受環(huán)境因素的影響，因此品種之間僅依靠形態(tài)學(xué)的差異進行鑒別十分困難，例如內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜研究所的甜菜品種內(nèi)2499和內(nèi)28102父本均為自交系RZ1，這就提高了形態(tài)鑒別的難度。其他作物，例如水稻（GB/T 1433-2007）和玉米（DB51/T 808-2008）等品種分子標記鑒定的國家標準和地方標準都是以SSR分子標記為基礎(chǔ)[30]，因此利用分子標記手段進行品種真實性和純度的鑒別將成為未來發(fā)展的必然趨勢。

本試驗擴大了供試品種的范圍，涵蓋了國內(nèi)多數(shù)的甜菜品種，有利于規(guī)范甜菜種質(zhì)資源，對市場的甜菜種子進行鑒定對開展甜菜基礎(chǔ)研究意義重大。本試驗也說明，SSR標記適用于甜菜品種純度和真實性的鑒定。但目前用于甜菜鑒定的分子標記開發(fā)較少，可利用的核心引物有限，開發(fā)多態(tài)性高的SSR引物，并進一步鑒定優(yōu)化影響甜菜品種純度和真實性的條件，建立一套快速鑒定甜菜品種純度和真實性的技術(shù)體系，為品種純度和真實性鑒定提供技術(shù)參考，建立完善的DUS測試技術(shù)體系，對今后甜菜品種的保護和市場良好發(fā)展意義重大。

4 結(jié)論

利用 20對 SSR標記引物對國內(nèi)已經(jīng)登記的107個甜菜品種進行了遺傳多樣性分析和品種鑒定。這20對SSR標記引物能夠?qū)?07個甜菜品種完全區(qū)分開來，達到了品種鑒定的要求。同一育種來源的品種具有更高的相似性。通過SSR引物多樣性分析得出SSD130、SB13、TC81、TC97和TC122多態(tài)性最高，可將這5對SSR引物作為甜菜品種鑒定的核心引物。