亓?xí)岳?李興鋒 呂廣德 王瑞霞 王 君孫憲印 孫盈盈 陳永軍 錢兆國 吳 科

（1泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，271000，山東泰安；2國家小麥改良中心泰安分中心，271018，山東泰安；3泰安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東泰安，271000）

小麥?zhǔn)俏覈蠹Z食作物之一，不斷提高小麥育種水平對于促進(jìn)小麥生產(chǎn)發(fā)展、保證國家糧食安全具有重要意義。近年來，由于商業(yè)化育種對新品種的迫切需要，在小麥雜交育種中主要利用大面積高產(chǎn)品種作為雜交親本，導(dǎo)致新育成的品種（系）間遺傳相似性不斷提高，突破性品種越來越少[1]。對小麥品種（系）進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳差異解析，能夠更好地了解不同品種（系）的遺傳特點(diǎn)，發(fā)掘優(yōu)異的種質(zhì)材料，對于指導(dǎo)小麥雜交育種的親本選配、提高小麥育種水平具有重要意義[2-3]。小麥基因組在DNA水平上的研究成果為分析小麥品種間的親緣關(guān)系提供了新的方法和手段。陸續(xù)有RAPD[4]、AFLP[5]和SSR[6-9]等標(biāo)記應(yīng)用于小麥種質(zhì)遺傳分析。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展及后來出現(xiàn)的自動(dòng)化 SNP芯片分型技術(shù)，使通過大規(guī)模高通量SNP基因芯片進(jìn)行小麥遺傳組成研究越來越普遍。SNP在定位目標(biāo)基因、構(gòu)建高密度遺傳圖譜和群體結(jié)構(gòu)分類等方面具有越來越大的使用價(jià)值和發(fā)展空間，如小麥遺傳圖譜的構(gòu)建[10-15]、分子標(biāo)記輔助選擇育種[16-18]、全基因組關(guān)聯(lián)分析[19-22]、遺傳多樣性[23-25]和物種進(jìn)化[26]研究等方面。曹廷杰等[23]利用Illumina 90k iSelect SNP標(biāo)記技術(shù)分析了河南省自2000年以來近14年審定小麥品種的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)，結(jié)果表明96個(gè)小麥品種中，多數(shù)品種親緣關(guān)系較近，94.3%的品種間遺傳相似系數(shù)在0.65～0.81之間；劉易科等[25]利用90K SNP芯片技術(shù)對我國主要小麥種植區(qū)的240個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行全基因組掃描，通過分析參試品種（系）間平均遺傳相似系數(shù)發(fā)現(xiàn)，參試品種（系）間平均遺傳相似系數(shù)變幅為0.13～0.99，有87.05%的品種（系）遺傳相似系數(shù)在0.60～0.78之間；聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國各省市部分單位因品種（系）交流頻繁，育成的品種（系）間出現(xiàn)遺傳相似性較高現(xiàn)象。自上世紀(jì)90年代至今，山東省泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院在經(jīng)歷了4次育種目標(biāo)更換，先后育成并審定15個(gè)小麥品種，目前還有多個(gè)小麥新品系正在參加國家和山東省小麥區(qū)域試驗(yàn)，其中以泰山27、泰山28和泰科麥33為代表的小麥品種，在小麥生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。這些小麥品種（系）的遺傳基礎(chǔ)及遺傳多樣性差異有待分析明確。利用小麥15 K育種芯片對21個(gè)供試小麥品種（系）進(jìn)行全基因組掃描，分析不同年份育成小麥品種（系）的遺傳距離，明確其位點(diǎn)/染色體區(qū)段構(gòu)成差異，揭示全基因組水平上的遺傳多樣性特點(diǎn)，解析遺傳差異的分子基礎(chǔ)，以期為小麥新品種組配和選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為山東省泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的21個(gè)小麥品種（系）。為了探討不同年份育成小麥品種（系）的遺傳構(gòu)成特點(diǎn)，將21份材料依據(jù)育成（審定）年份，分成1990-1999年（90s）期間、2000-2009年（00s）期間、2010-2019年（10s）期間和現(xiàn)在（Present）4個(gè)時(shí)期進(jìn)行分析（表1）。

表1 供試小麥材料名稱、組合及審（認(rèn)）定時(shí)間Table 1 Wheat materials, combinations and released time

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集供試材料的新鮮葉片組織，利用CTAB法提取基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀（Nano Drop ND-2000，美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測DNA質(zhì)量及濃度，確保達(dá)到后續(xù)芯片試驗(yàn)要求。

1.2.2 SNP位點(diǎn)分型和質(zhì)檢分析 利用小麥 15 K育種芯片對供試小麥品種（系）進(jìn)行全基因組掃描，在中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司平臺進(jìn)行樣本DNA的SNP分型，共獲得13 947個(gè)SNP位點(diǎn)分型數(shù)據(jù)。為進(jìn)一步獲取高質(zhì)量的基因分型結(jié)果，對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和過濾，選取在芯片檢測中Call rate均大于97%的位點(diǎn)標(biāo)記，過濾后得到10 101個(gè)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果，剔除基因型檢出率小于80%的SNP位點(diǎn)，剩余8692個(gè)SNP位點(diǎn)。此外，由于雜合位點(diǎn)在后代會(huì)產(chǎn)生分離而干擾檢測結(jié)果的精密度，因此進(jìn)一步篩選去除樣品中出現(xiàn)雜合分型的位點(diǎn)，最終在所有檢測品種（系）中共獲得2082個(gè)純合的SNP位點(diǎn)。結(jié)合SNP位點(diǎn)在小麥基因組對應(yīng)位置分析，最終獲得2029個(gè)定位于小麥21條染色體上的SNP位點(diǎn)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)合小麥15 K育種芯片基因型數(shù)據(jù)信息，將獲得的2029個(gè)SNP數(shù)據(jù)分別轉(zhuǎn)換為0（最小等位基因型）和1（相對等位基因型）格式，建立原始矩陣。統(tǒng)計(jì)所有SNP位點(diǎn)多態(tài)性信息指數(shù)（PIC），同時(shí)利用SNP分子數(shù)據(jù)建立的0～1數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行每個(gè) SNP位點(diǎn)的等位變異豐富度（Aij）和PIC的估算，同時(shí)估算A、B和D基因組及全基因組的遺傳豐富度（Ri）和多樣性指數(shù)（Ht），具體計(jì)算參考郝晨陽等[27]方法。利用 NTSYS-PC ver.2.2軟件中的“DICE”計(jì)算品種間遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group method arithmetic averages，UPGMA）繪制遺傳關(guān)系樹狀圖[28]。用“1-DICE”表示遺傳距離，計(jì)算不同年代育成品種（系）的平均遺傳距離。

1.2.4 基因型圖譜構(gòu)建 結(jié)合小麥15 K育種芯片物理位置信息，隨機(jī)選擇均勻分布于全基因組的403個(gè)SNP標(biāo)記（每條染色體約20個(gè)）繪制21個(gè)小麥品種（系）的基因型圖譜。根據(jù)以上各SNP位點(diǎn)的等位變異的堿基序列在染色體上標(biāo)記不同顏色，其中AA標(biāo)記為紅色、TT標(biāo)記為綠色、CC標(biāo)記為黃色、GG標(biāo)記為藍(lán)色、NN（缺失）標(biāo)記為黑色。利用MapChart 2.32繪制21個(gè)小麥品種（系）基因型圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)的遺傳多樣性

根據(jù)基因分型結(jié)果，比較2029個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)在A、B、D 3個(gè)基因組、7個(gè)同源群和21條染色體的分布特點(diǎn)。結(jié)果（表2）表明，2029個(gè)SNP基因位點(diǎn)在A、B、D基因組中的分布分別為730、820和479個(gè)，A、B、D基因組平均等位變異豐富度分別為2.07、2.14和2.13，平均遺傳多樣性指數(shù)分別為0.24、0.24和0.21。綜合2個(gè)多樣性指標(biāo)可以看出，B基因組的遺傳多樣性最高，其次是A和D基因組。由圖1可知，在7個(gè)同源群中，平均等位變異豐富度依次為 H3＞H6＞H7＞H5＞H2＞H4＞H1，平均遺傳多樣性指數(shù)依次為H6＞H3＞H2＞H7＞H5＞H1＞H4。綜合2個(gè)多樣性指數(shù)可以看出，二者的分布變化趨勢基本一致，第3和第6同源群具有較高的遺傳多樣性，第1和第4同源群的遺傳多樣性較低。

表2 3個(gè)基因組的遺傳多樣性比較Table 2 Genetic diversity comparison of three genomes

圖1 育成品種（系）7個(gè)同源群的遺傳多樣性Fig.1 Genetic diversity of seven homologous groups of the varieties (lines)

由圖2可知，在21條染色體中，A基因組的1A染色體的變異豐富度和遺傳多樣性指數(shù)均很低，6A的平均等位變異豐富度偏低；B基因組染色體的平均等位變異豐富度和多樣性指數(shù)均較高，且2個(gè)指標(biāo)變化趨勢基本一致；D基因組的2D和6D染色體的平均等位變異豐富度較高。整體來看，3A、1B、6B染色體的遺傳多樣性較高，而1A、6A的遺傳多樣性偏低。

圖2 育成品種（系）21條染色體的遺傳多樣性Fig.2 Genetic diversity of 21 chromosomes of varieties (lines)

2.2 供試材料的遺傳距離分析

結(jié)果（圖3）表明，不同年份小麥品種（系）平均遺傳距離的變異范圍為0.00～0.37。從平均遺傳距離的變化曲線來看，自90s以來，遺傳距離總體呈先升后降趨勢。由于只有1個(gè)90s育成品種，其平均遺傳距離為0.00，00s品種（系）間的平均遺傳距離為0.10，10s品種（系）間平均遺傳距離出現(xiàn)最高值0.37后，現(xiàn)在（Present）品種（系）的平均遺傳距離為0.07，降到最低。

圖3 不同年代選育品種（系）的平均遺傳距離Fig.3 Average genetic distance of wheat varieties (lines) in different ages

2.3 供試材料的聚類分析

為明確21個(gè)小麥品種（系）之間的親緣關(guān)系及與系譜關(guān)系是否吻合，對其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖4）表明，21個(gè)供試小麥品種（系）間的遺傳相似系數(shù)在0.69～0.99之間。除早熟高產(chǎn)品種泰山24、優(yōu)質(zhì)品種泰山 27、高產(chǎn)品種泰科麥 30、高產(chǎn)節(jié)水型品種泰科麥 32和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種泰科麥 33外，其余品種（系）可以分為4個(gè)類群。90s育成的早熟高產(chǎn)品種魯麥18和00s育成的早熟超高產(chǎn)品種泰山23歸為類群Ⅰ；00s育成的早熟高產(chǎn)品種泰山21、大穗高產(chǎn)品種泰山9818和早熟高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種泰山22歸為類群Ⅱ；類群Ⅲ為10s和現(xiàn)在育成的小麥品種（系），包括高產(chǎn)品種泰科麥31和特用品種泰科紫麥1號，高產(chǎn)節(jié)水品系泰科麥38、高產(chǎn)品系泰科麥308、早熟品系泰科麥6007、優(yōu)質(zhì)品系泰科麥36、高產(chǎn)品系TKM0564和TKM7105等；類群Ⅳ主要為10s和現(xiàn)在育成品種（系），包括高產(chǎn)品種泰山28、高產(chǎn)新品系泰科麥34和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗倒新品系 TKM6215，基本上同一年份育成的品種（系）聚在一起，跟系譜關(guān)系（表1）較為吻合。

圖4 小麥品種的UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of wheat cultivars

2.4 供試材料的共有位點(diǎn)/染色體區(qū)段

根據(jù)2029個(gè)定位的純合SNP標(biāo)記的物理位置隨機(jī)選取均勻分布染色體的403個(gè)SNP標(biāo)記（每條染色體約20個(gè)），繪制21個(gè)供試小麥品種（系）的基因型圖譜。

表3和圖5表明，在不同的年份（00s、10s和Present）育成小麥品種（系）間的共有SNP的數(shù)量、基因組分布和同源群分布均有差異。00s育成的 5個(gè)小麥品種攜帶的共有SNP為203個(gè)，主要分布在A、B基因組和H4、H7同源群；10s育成的7個(gè)小麥品種攜帶的共有SNP為122個(gè)，主要分布在D和A基因組和H2、H6同源群；Present育成的8個(gè)小麥品種（系）攜帶的共有SNP為251個(gè)，主要分布在A和B基因組和H2、H3同源群。分析同一年份育成的品種（系）共有的染色體區(qū)段情況發(fā)現(xiàn)：00s育成的5個(gè)小麥品種攜帶的相同染色體區(qū)段主要分布在1A、2A、7A、3B、4B、6B和4D染色體上，共包含57個(gè)位點(diǎn)；10s育成的7個(gè)小麥品種攜帶的相同染色體區(qū)段主要分布在1A、2A、2D、5D、6B、6D和7D染色體上，共包含53個(gè)位點(diǎn)；Present育成的8個(gè)小麥品種（系）攜帶的相同染色體區(qū)段主要分布在2A、4A、7A、2B、3B、4B、6B和6D染色體上，共包含109個(gè)位點(diǎn)（附表1）。

表3 不同育種年份間共有的SNP數(shù)量、基因組（A、B、D）分布和同源群（H1～H7）分布Table 3 The number of SNP, genome (A, B and D)distribution and homologous groups (H1-H7)distribution in different breeding year

進(jìn)一步比較21個(gè)供試小麥品種（系）基因型圖譜，發(fā)現(xiàn)含有25個(gè)共同的SNP位點(diǎn)（圖5），這些共有SNP位點(diǎn)分布在1A、5A、6A、7A、2B、3B、6B、1D、2D、3D和7D染色體上，且每條染色體上分布SNP位點(diǎn)的數(shù)目均不相同，其中1A染色體上的 AX-111786969-AX、109920244-AX、110049336、AX-110094282和AX-109335959位點(diǎn)成簇分布。

圖5 21個(gè)小麥品種（系）的基因型圖譜Fig.5 Genotypic maps of 21 wheat varieties (lines)

3 討論

高通量測序和DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥遺傳進(jìn)化研究、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和優(yōu)異基因發(fā)掘等方面。很多研究[15, 22-23, 25-26, 30-31]均證明SNP標(biāo)記是研究小麥遺傳多樣性、種屬間親緣關(guān)系、品種及基因型鑒定和標(biāo)記輔助育種的有效工具。

本研究結(jié)果表明不同年份小麥品種（系）平均遺傳距離呈先升高后下降的趨勢。在 90s，因僅育成1個(gè)小麥品種，平均遺傳距離為0.00，無法比較；00s育成品種的平均遺傳距離為0.10，可能與較多地利用魯麥14[32]、魯麥18及其衍生后代作為雜交親本有關(guān)；10s育成品種平均遺傳距離為0.37，達(dá)到最高值，在親本的利用上引入了親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的優(yōu)質(zhì)材料；現(xiàn)在育成品種（系）間的平均遺傳距離出現(xiàn)下降趨勢，可能與較多地利用大面積高產(chǎn)品種作為雜交親本有一定關(guān)系。本研究的聚類分析結(jié)果可將供試材料大致分為4個(gè)類群，且同一年份的品種（系）基本聚在一起，與系譜分析結(jié)果吻合。例如，類群Ⅰ的2個(gè)品種親本86026和881414親緣關(guān)系較近；類群Ⅱ中的泰山21和泰山22的親本之一都是魯麥18；類群Ⅲ的8個(gè)品種（系）中，泰科麥31和TKM7105的共同親本為泰山26，泰科麥 0311和TKM0564的親本均含有煙麥系列的血緣，泰科紫麥1號和泰科麥38均含有良星系列的親本。另外，未被聚類的5個(gè)育成小麥品種（系）的親本中含有鄭州8329、藏選1號、漯麥9424、洛旱3號、萊州3279、鄭麥366和淮陰9908等的遺傳區(qū)段或位點(diǎn)，與前面4個(gè)類群所用親本的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

目前育成小麥品種（系）間的遺傳相似性較高，遺傳多樣性降低已成為一種普遍現(xiàn)象。郝晨陽等[27]通過分析我國育成品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)從20世紀(jì) 50年代起，我國小麥育成品種的遺傳多樣性指數(shù)和品種間平均遺傳距離逐步下降；王江春等[6]研究表明，山東省小麥品種遺傳距離總體呈下降趨勢，50年代品種間的遺傳距離最大，之后逐漸降低，80年代達(dá)到最低，90年代出現(xiàn)一個(gè)高值后又明顯降低；程斌等[33]選用53個(gè)SSR引物對96個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行了遺傳多樣性分析，證明山東省近年來育成小麥品種（系）遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄、多態(tài)性呈下降的趨勢。因此，拓寬小麥品種的遺傳基礎(chǔ)，提高育成品種的遺傳多樣性，是今后小麥品種遺傳改良研究中值得重視和亟待解決的問題。

通過分析不同年份育成小麥品種（系）共有SNP和共有染色體區(qū)段基因組分布情況發(fā)現(xiàn)，00s、10s和Present育成的小麥品種（系）共有SNP和共有染色體區(qū)段分別主要分布在 A、D和 B基因組。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)A基因組含有豐富的與磷高效[34]、株高[35-36]、千粒重[37]、抽穗期[38]、分蘗數(shù)[39]、Glu-A3[40]、產(chǎn)量[41]和籽粒性狀[42]等重要性狀相關(guān)的基因；B基因組含有豐富的與株高[36,43]、穗長[44]、分蘗數(shù)[34]、抽穗期[45-47]、成熟期[37,45]、磷高效[34]、籽粒/面粉蛋白質(zhì)[48]和抗逆[15,41,49]等重要性狀相關(guān)的基因；D基因組含有豐富的植物抗逆[15,38,49]、高產(chǎn)[41,50]和優(yōu)質(zhì)[51-52]等優(yōu)異基因。以上結(jié)果與本文不同年份育種目標(biāo)吻合，如00s的高產(chǎn)早熟目標(biāo)、10s高產(chǎn)抗逆目標(biāo)及現(xiàn)在的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、多抗和節(jié)本安全等目標(biāo)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)21份供試材料均含有25個(gè)共同的SNP位點(diǎn)，分布在1A、5A、6A、7A、2B、3B、6B、1D、2D、3D和7D染色體上。通過對比已報(bào)道的小麥產(chǎn)量等QTL信息[15, 34, 36-37, 41-43, 45-46, 49-50, 53-58]，并選取物理位置10Mb之內(nèi)的QTL分析發(fā)現(xiàn)，25個(gè)SNP位點(diǎn)與增加產(chǎn)量的QTL（如產(chǎn)量、千粒重、穗粒數(shù)和單株穗數(shù)等）、控制株高的QTL、增加分蘗數(shù)的QTL、控制開花期和抽穗期的QTL、提高葉銹病和白粉病抗性的 QTL以及提高灌漿速率的QTL等存在密切關(guān)系。以上供試材料的遺傳分析結(jié)果可能與品種選育過程中注重選擇攜帶控制重要性狀的關(guān)鍵基因有關(guān)，所以在雜種后代中受到較多的選擇和保留。

4 結(jié)論

21個(gè)小麥品種（系）間的遺傳差異日趨縮小，遺傳多樣性逐漸降低；同一年份的品種（系）基本聚在同一類群，與其系譜關(guān)系吻合；同一年份育成的小麥品種（系）攜帶相同的SNP或染色體區(qū)段與不同年份的育種目標(biāo)吻合；在品種（系）組配與選育過程中注重產(chǎn)量、株高、分蘗數(shù)、抽穗期、灌漿速率和抗病等性狀的選擇，可為今后小麥新品種選育提供參考依據(jù)。