段振盈 徐新玉 李 星 李在峰 馬 駿 姚占軍

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，071001，河北保定；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，071001，河北保定；3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，100193，北京）

由葉銹菌（Pucciniatriticina）引起的小麥葉銹病是氣傳性真菌病害，其危害性大、易侵染且傳播距離遠(yuǎn)[1]。葉銹菌秋季侵染幼苗并向臨近傳播，以菌絲體潛伏在葉片內(nèi)或以夏孢子越冬，待溫度適宜，菌絲體或夏孢子便開(kāi)始復(fù)蘇產(chǎn)生新孢子侵染寄主，導(dǎo)致病害發(fā)生和流行[2-3]。病害發(fā)生年份減產(chǎn)5%～15%，流行年份減產(chǎn) 40%甚至更高[4-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年小麥種植面積約0.23億hm2，葉銹病發(fā)生面積約0.15億hm2，特別是西南、西北和長(zhǎng)江中下游麥區(qū)發(fā)生嚴(yán)重[7]。受氣候變化和耕種方式改變的影響，我國(guó)葉銹菌生理小種多樣性呈增加趨勢(shì)，各小麥主產(chǎn)區(qū)都存在多個(gè)葉銹菌流行小種，其中分布較廣、危害較大的是THTT、THTS、THSS、PHTT和THKS[8]。當(dāng)前，該病害防治主要依靠合理的抗病品種布局、栽培管理和藥劑施用等措施[9]。由于藥劑防治耗時(shí)耗力，增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，且污染環(huán)境。因此，通過(guò)雜交育種聚合抗病基因來(lái)培育新的抗病品種[10-11]是抑制小麥葉銹病流行的重要途徑[12]。

我國(guó)小麥品種資源豐富，可從中篩選出優(yōu)秀的抗源材料。目前，利用基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記檢測(cè)相結(jié)合是鑒定小麥抗病基因最快速便捷的方法。鄭慧敏等[13]在70份小麥品種（系）中利用12個(gè)與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，結(jié)合基因推導(dǎo)和系譜分析，推導(dǎo)出Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr11、Lr17、Lr30、Lr10等15個(gè)抗葉銹病基因，并篩選出 39份慢銹品種，可為小麥抗葉銹病育種提供抗源材料；張林等[14]利用基因推導(dǎo)法對(duì)山東省12個(gè)主栽小麥品種（系）進(jìn)行抗葉銹性基因分析，推導(dǎo)出Lr1、Lr16、Lr26、Lr37等抗葉銹病基因；焦悅等[15]在來(lái)自國(guó)外的50個(gè)小麥品種（系）中推導(dǎo)出Lr1、Lr26、Lr34、Lr37等8個(gè)抗葉銹病基因，并篩選出19個(gè)慢銹品種（系）。通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外小麥生產(chǎn)品種進(jìn)行基因推導(dǎo)分析，明確其中的抗葉銹病基因及篩選出慢銹性品種，為今后品種的合理布局和抗病育種提供理論支持。

隨著小麥葉銹病抗性研究的不斷發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多個(gè)抗葉銹病基因，正式命名至Lr79[16]。其中Lr10、Lr14a、Lr16、Lr17、Lr26、Lr34、Lr35和Lr36等基因在田間已基本喪失抗病性，僅Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr45、Lr78和Lr79等仍具有良好的抗病性[17]，因此鑒定小麥品種中含有的抗葉銹病基因，對(duì)培育抗葉銹病品種具有重要意義。本研究利用苗期基因推導(dǎo)法、分子標(biāo)記檢測(cè)與系譜分析對(duì) 12個(gè)小麥品種進(jìn)行抗葉銹病基因檢測(cè)，成株期根據(jù)田間病情指數(shù)篩選出慢銹性品種。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥材料及菌株為12個(gè)小麥品種、35個(gè)含已知抗葉銹病基因的近等基因系、感病對(duì)照品種鄭州5389、成株慢銹對(duì)照品種SAAR、19個(gè)不同毒性的葉銹菌生理小種和田間接種所用的混合生理小種（THTT、THTS和PHTT），均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹菌研究室保存并提供，所用菌株均由流行菌株在溫室中分離純化獲得。葉銹菌生理小種依據(jù)Long[18]提出的葉銹菌密碼命名系統(tǒng)進(jìn)行命名。

1.2 方法

1.2.1 苗期侵染及基因推導(dǎo) 35個(gè)近等基因系、感病對(duì)照品種鄭州5389和12個(gè)小麥品種經(jīng)催芽后種植于溫室育苗穴盤中，待小麥生長(zhǎng)至一葉一心時(shí)，采用掃抹法接種19個(gè)不同毒性的葉銹菌生理小種，依據(jù)Roelfs等[19]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗葉銹病鑒定，并根據(jù)Dubin等[20]提出的方法進(jìn)行基因推導(dǎo)?；蛲茖?dǎo)法以Flor[21]提出的基因?qū)蚣僬f(shuō)為原理，依據(jù)不同葉銹菌生理小種對(duì) 35個(gè)近等基因系的侵染型來(lái)鑒別生理小種的毒性譜，并將相同的生理小種接種到待測(cè)品種，通過(guò)待測(cè)品種對(duì)這些菌系的抗感表現(xiàn)推導(dǎo)其含有的抗性基因。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè) 用 CTAB 法[22]提取供試材料的小麥幼葉全基因組 DNA，參照 Sharp等[23]的方法，使用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，稀釋至40～50ng/μL的PCR工作液，利用12個(gè)與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。20μL PCR反應(yīng)體系為2μL DNA模板、2μL引物、10μL 2×TaqPCR Mix和6μL ddH2O。反應(yīng)程序及引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳或12%非變性聚丙酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

表1 分子標(biāo)記的引物序列及PCR擴(kuò)增程序Table 1 Primer sequences and PCR amplification programs

1.2.3 成株期抗性調(diào)查 2017和2018年10月下旬將12個(gè)小麥品種、感病對(duì)照品種鄭州5389和慢銹對(duì)照品種 SAAR采用人工撒種條播[35]于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田（115.47°E，38.85°N）。小麥返青后（約4月初）進(jìn)行接種，將菌種（THTT、THTS和PHTT）混合后用0.03%吐溫20制成0.3～0.5g/L孢子懸浮液，用噴霧法接種于誘發(fā)行，接種后覆膜，黑暗保濕 14～16h，揭去地膜后自然生長(zhǎng)。待鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度至50%時(shí)進(jìn)行第1次調(diào)查[36]，記錄苗期侵染型、發(fā)病普遍率和嚴(yán)重度，并計(jì)算病情指數(shù)[37]，之后每隔1周調(diào)查1次，直至感病對(duì)照品種鄭州5389嚴(yán)重度高于90%，一般調(diào)查3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥苗期侵染結(jié)果

參考Colin等[38]的方法進(jìn)行基因推導(dǎo)（表2），攜帶Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr3bg、Lr23和Lr33的載體品系對(duì) 19個(gè)生理小種均表現(xiàn)為感病，晉麥2148、小偃6號(hào)、溫麥6號(hào)這3個(gè)品種的抗性譜與其相同或相似，尚不能確定其中是否含有抗葉銹病基因。平陽(yáng)27、石特14、煙農(nóng)15這3個(gè)供試品種對(duì)葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為抗病，含有已知抗葉銹病基因Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51的載體品系對(duì)葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為抗病，但平陽(yáng)27的表現(xiàn)型高于Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51載體品系的表現(xiàn)型，推測(cè)平陽(yáng) 27中不含Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51；且對(duì)菌種PHGL、TGKS和PHTS的表現(xiàn)型高于Lr24和Lr29的載體品系，推測(cè)其不含Lr24和Lr29；對(duì)菌種FHSQ、PHDQ、PHGL、TGKS和PHTS的表現(xiàn)型高于Lr42的載體品系，推測(cè)其不含Lr42；同理推測(cè)出石特14、煙農(nóng) 15中均不含有Lr9、Lr24、Lr19、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51。這3個(gè)品種在接種19個(gè)葉銹菌生理小種后表現(xiàn)出良好的抗性，可能含有其他未知基因，無(wú)法依靠現(xiàn)有的近等基因系推斷出其含有的抗葉銹病基因。石新 828僅對(duì)菌種 TGKS表現(xiàn)為抗病，對(duì)其他小種均表現(xiàn)為感?。粷?jì)南 2號(hào)對(duì)FHDQ①、FHGQ②、TGKS、FHJS②生理小種均表現(xiàn)為抗病，對(duì)其他小種均表現(xiàn)為感??；碧螞 4號(hào)對(duì)FHJR、FGBQ、FHDQ①、FHGQ②、FHJT、TGKS、FHJS②和FHDQ②表現(xiàn)為抗病，對(duì)其他小種表現(xiàn)為感??；碧螞1號(hào)對(duì)FGKQ和FGBQ 2個(gè)生理小種表現(xiàn)為抗病，對(duì)其他小種表現(xiàn)為感病。這4個(gè)品種對(duì)19個(gè)葉銹病生理小種的抗性譜與任一載體品系的抗性譜均不相同，推斷其可能含有其他未知抗病基因。百農(nóng)3217及Lr1的載體品系對(duì)PHDQ、TGKS生理小種均表現(xiàn)為感病，但百農(nóng)3217的抗性譜較寬，因此推測(cè)百農(nóng)3217中含有Lr1和其他未知基因。泰山 1號(hào)及Lr26的載體品系對(duì) FGKQ、FGBQ、TGKS表現(xiàn)為抗病，且泰山1號(hào)的抗性譜較寬，推測(cè)泰山1號(hào)中含有Lr26和其他未知抗病基因。

表2 35個(gè)載體品系、12個(gè)供試品種及感病對(duì)照品種鄭州5389對(duì)19個(gè)菌系苗期抗性鑒定結(jié)果Table 2 The results of identification of resistance of 35 vector lines, 12 tested varieties and the control variety Zhengzhou 5389 to 19 pathotypes of P.triticina at seedling stage

續(xù)表2 Table 2 (continued)

2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)12個(gè)與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的STS和 SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行分析。分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，在供試品種中擴(kuò)增出與Lr34（150bp）、Lr37（259bp）、Lr1（760bp）、Lr26（1076bp）、Lr46（520bp）抗葉銹病基因大小相同的目的片段，未擴(kuò)增出與抗葉銹病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24大小相同的目的片段，由此推測(cè)供試品種中不含抗葉銹病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24。其中與Lr34連鎖的標(biāo)記引物csLV34在石特14中擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段，表明石特14中可能含有Lr34（圖1a）；與Lr37連鎖的分子標(biāo)記在泰山1號(hào)和溫麥6號(hào)中均擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段，表明泰山1號(hào)和溫麥6號(hào)中可能含有Lr37（圖1b）；與Lr1緊密連鎖的標(biāo)記引物WR003在石特14中擴(kuò)增出相同的特異性片段，表明石特14可能含有Lr1（圖1c）；與Lr26連鎖的正相關(guān)分子標(biāo)記引物ω-secalin在泰山1號(hào)和石特14中均能擴(kuò)增出特異性片段，并且用負(fù)相關(guān)分子標(biāo)記Glu-B3均未擴(kuò)增出特異性片段，表明泰山1號(hào)和石特14中可能存在抗病基因Lr26（圖1d和圖1e）；石新828、濟(jì)南2號(hào)、泰山1號(hào)、晉麥2148、煙農(nóng)15、小偃6號(hào)和溫麥6號(hào)中均擴(kuò)增出Lr46的特異性片段，推測(cè)這7個(gè)小麥品種中含有成株抗葉銹病基因Lr46（圖1f）。

圖1 12個(gè)小麥品種中含有的抗葉銹病基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR amplification and molecular marker detection results of 12 wheat varieties

2.3 小麥成株期抗性調(diào)查結(jié)果

2017-2018和2018-2019年度供試品種與對(duì)照品種嚴(yán)重度、普遍率調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表3。感病對(duì)照品種鄭州5389在2個(gè)環(huán)境下均充分發(fā)病，保證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。慢銹對(duì)照品種SAAR在田間的嚴(yán)重度在2個(gè)環(huán)境下均為1，為明顯的慢銹性。根據(jù)NY/ZB 592.2-2007，苗期侵染型等級(jí)為3級(jí)及3級(jí)以上且病情指數(shù)嚴(yán)重度×普遍率＜30%為慢銹性品種[39]。百農(nóng)3217、平陽(yáng)27、濟(jì)南2號(hào)、泰山1號(hào)、石特14、晉麥2148、碧螞4號(hào)、煙農(nóng)15、小偃6號(hào)、溫麥6號(hào)共10個(gè)品種在田間對(duì)混合葉銹菌生理小種苗期侵染型為3級(jí)或以上，成株期嚴(yán)重度均小于30%，且病情指數(shù)較小，表現(xiàn)慢銹性。綜合2年度調(diào)查結(jié)果篩選出以上10個(gè)小麥品種為慢葉銹性品種，可為培育抗病品種提供抗源材料。

表3 12個(gè)供試品種、慢銹對(duì)照SAAR和感病對(duì)照鄭州5389成株期對(duì)混合小種侵染型、嚴(yán)重度、普遍率和病情指數(shù)結(jié)果Table 3 Infection types to Puccinia triticina, final disease severity, general rate, disease index results of 12 tested varieties, slow rust cultivar SAAR and susceptible cultivar Zhengzhou 5389

3 討論

通過(guò)查詢品種系譜分析得出，百農(nóng)3217由（阿夫×內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)）×咸農(nóng)39為母本、西農(nóng)64×偃大24為父本雜交選育而來(lái)，阿夫是2個(gè)意大利小麥品種Duecentodieci與Damiano的雜交后代[40]，于1956年引入我國(guó)，劉新春等[41]在阿夫中檢測(cè)到抗葉銹病基因Lr1，通過(guò)基因推導(dǎo)在百農(nóng)3217中發(fā)現(xiàn)Lr1，推測(cè)百農(nóng)3217的抗葉銹性來(lái)源于阿夫。晉麥2148是以（晉江赤子×華東5號(hào)）×歐柔為母本、瑞托為父本雜交而來(lái)，丁艷紅等[42]推測(cè)歐柔中含有抗葉銹病基因Lr34、Lr16、Lr11、Lr3bg和Lr33，由此推測(cè)晉麥2148的抗葉銹性來(lái)源于歐柔。百農(nóng)3217和晉麥2148中均檢測(cè)出抗葉銹病基因Lr1，Lr1最早由Mclntosh等[43]定位在5DL染色體上，隨后被成功克隆[44]。據(jù)報(bào)道，Lr1目前已喪失抗性，但與其他抗病基因共同存在時(shí)仍能表現(xiàn)良好的抗性，百農(nóng)3217和晉麥2148成株期表現(xiàn)出良好的抗性，可能含未知抗病基因，與基因推導(dǎo)結(jié)果吻合。濟(jì)南2號(hào)（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥）、碧螞1號(hào)（螞蚱麥/碧玉麥）與碧螞4號(hào)（螞蚱麥/碧玉麥）的遺傳背景相似，均包含螞蚱麥和碧玉麥，孟倩等[45]在螞蚱麥中檢測(cè)到慢銹性基因Lr34，但通過(guò)分子標(biāo)記在濟(jì)南2號(hào)、碧螞1號(hào)、碧螞4號(hào)中均未檢測(cè)出Lr34，可能是在雜交過(guò)程中發(fā)生遺傳重組或抗葉銹病基因Lr34的丟失，因此其抗性可能由其他抗性基因提供。魏新燕等[46]在碧螞 1號(hào)中檢測(cè)到抗病基因Lr35，本試驗(yàn)中推導(dǎo)出碧螞1號(hào)中含有未知抗病基因，未對(duì)抗葉銹病基因Lr35進(jìn)行檢測(cè)，是否為相同的抗葉銹病基因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。平陽(yáng)27、濟(jì)南2號(hào)、石特14、晉麥2148、煙農(nóng)15、小偃6號(hào)和溫麥6號(hào)表現(xiàn)慢銹性可能是慢銹基因Lr46和其他加性效應(yīng)基因共同作用的結(jié)果。其中平陽(yáng)27、石特14和煙農(nóng)15在苗期對(duì)19個(gè)葉銹菌生理小種均表現(xiàn)抗病，在田間對(duì)毒性較強(qiáng)的混合生理小種表現(xiàn)感病，且侵染型在3級(jí)及以上，推測(cè)其抗病基因表達(dá)可能受多基因互作和環(huán)境條件的影響。Lr46來(lái)源于品種Pavon 76，被定位在1BL染色體上[47]。該基因?yàn)槁P性基因，目前在田間仍具有良好抗性。本研究利用與Lr46緊密連鎖的分子標(biāo)記在7個(gè)小麥品種中檢測(cè)出成株期抗病基因Lr46，其中有6個(gè)小麥品種在成株期表現(xiàn)慢銹性，與檢測(cè)結(jié)果一致；石新 828中僅檢測(cè)到Lr46，但成株期病情指數(shù)高于30%，表明其抗病性可能受環(huán)境微觀影響或存在Lr46的抑制基因，其具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)合基因推導(dǎo)、系譜分析和分子標(biāo)記檢測(cè)多種方法，對(duì) 12個(gè)小麥品種抗葉銹病基因進(jìn)行了分析?；蛲茖?dǎo)法方便快捷、檢測(cè)周期短，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量品種進(jìn)行檢測(cè)，但由于該方法僅依靠人為因素對(duì)小麥侵染型進(jìn)行鑒定，通過(guò)病原物與植物之間相互作用后的侵染型來(lái)判斷供試品種中所含有的抗性基因，可能判斷錯(cuò)誤導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)某些抗性基因，所以存在一定的局限性。此外，有些小麥品種遺傳背景豐富，系譜復(fù)雜，可能存在多個(gè)抗性基因，基因間的互作效應(yīng)也可能影響推導(dǎo)結(jié)果。因此，結(jié)合系譜分析一定程度上彌補(bǔ)了基因推導(dǎo)法的不足。分子標(biāo)記檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便，利用分子標(biāo)記對(duì)供試品種進(jìn)行檢測(cè)，不受環(huán)境因素、發(fā)育時(shí)期、遺傳背景、菌種毒力和基因互作等因素的影響。田間成株期抗性鑒定利用人工接種毒性較強(qiáng)的葉銹菌生理小種，自然誘發(fā)并結(jié)合作物的真實(shí)生長(zhǎng)環(huán)境更具有說(shuō)服力。為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)以基因推導(dǎo)法為基礎(chǔ)，結(jié)合系譜分析、分子標(biāo)記檢測(cè)和成株期抗性鑒定，對(duì)供試品種抗葉銹病基因進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力。

4 結(jié)論

綜合苗期基因推導(dǎo)、系譜分析及分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，在12個(gè)小麥品種中發(fā)現(xiàn)Lr1、Lr26、Lr34、Lr37和Lr465個(gè)抗葉銹病基因，其中2個(gè)品種含Lr1，2個(gè)品種含Lr26，1個(gè)品種含Lr34，2個(gè)品種含Lr37，7個(gè)品種含Lr46，3個(gè)品種在利用現(xiàn)有條件下并未發(fā)現(xiàn)抗葉銹病基因。通過(guò)成株期抗性鑒定篩選出百農(nóng)3217、平陽(yáng)27、濟(jì)南2號(hào)、泰山1號(hào)、石特14、晉麥2148、碧螞4號(hào)、煙農(nóng)15、小偃6號(hào)和溫麥6號(hào)共10個(gè)慢葉銹性品種，這些小麥品種中含有1個(gè)或多個(gè)抗葉銹病基因，可為后續(xù)培育新的小麥抗病品種提供抗源及理論支持。