宋坤鋒 郝風(fēng)聲 姚 欣 王 靜 劉衛(wèi)群

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，450002，河南鄭州；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，100089，北京）

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）屬于正義單鏈RNA病毒，具有非常強(qiáng)的傳染性，葫蘆科、茄科和十字花科等38科268種植物均能被TMV感染[1]。由TMV引起的病害是作物生產(chǎn)主要的病害之一，會使作物的品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響。對 TMV發(fā)生規(guī)律和防治等方面已有大量的研究。林祥永等[2]研究發(fā)現(xiàn)，品種、栽培方式和氣象因素都會影響煙草花葉病的發(fā)病率。從三葉鬼針草中提取的黃酮甙對TMV的抑制效果可達(dá)91.3%，表明外源施加化學(xué)或生物源物質(zhì)能夠有效抑制TMV的侵染[3]。此外，將基因技術(shù)應(yīng)用在抗TMV的外殼基因、運(yùn)動蛋白基因和復(fù)制酶基因等方面進(jìn)行TMV的防治，也取得了較好的效果。如顏培強(qiáng)等[4]用編碼 TMV外殼蛋白的 RNA片段構(gòu)建反義基因，導(dǎo)入植株對TMV呈現(xiàn)免疫級抗性。植物在與病原物共同進(jìn)化的過程中逐漸形成了自身免疫防御系統(tǒng)。利用植物體內(nèi)的抗性基因進(jìn)行病害防治，具有無環(huán)境污染、整個植物生長時期都起防治作用的優(yōu)點(diǎn)。如Stange等[5]研究發(fā)現(xiàn)，煙草NH基因通過激活植物過敏反應(yīng)和防御相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)煙草對TMV的防御。本課題組前期在2個對TMV侵染具有不同耐受性品種研究[6]中發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白家族中的14-3-3-like C、14-3-3 h1和14-3-3 h2等7個蛋白在不同耐受品種中的表達(dá)量均發(fā)生變化，說明14-3-3蛋白可能在TMV侵染過程中起著重要作用。

14-3-3蛋白家族是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中高度保守的調(diào)控蛋白，通常由多個基因編碼成不同的亞型，不同亞型之間能夠形成同源或異源二聚體。作為具有多亞型的蛋白家族，14-3-3蛋白發(fā)揮功能的方式也多種多樣，其不僅可作為激活因子或抑制因子調(diào)控靶蛋白的結(jié)構(gòu)、活性以及穩(wěn)定性，還參與調(diào)控靶蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與亞細(xì)胞定位[7]，甚至還可以發(fā)揮與分子伴侶相似的功能，協(xié)助蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。14-3-3蛋白通過與相應(yīng)的靶蛋白結(jié)合，在植物生長發(fā)育、代謝、物質(zhì)運(yùn)輸和逆境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用，如參與植物初級代謝[9]、生長發(fā)育[10]、生物和非生物應(yīng)答[11]、氣孔運(yùn)動[12]、油脂合成[13]等。14-3-3蛋白在植物―病原互作中也具有重要作用。Taylor等[14]發(fā)現(xiàn)番茄14-3-3蛋白基因TFT1是PAMPs引發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）所必需的，從而引起該途徑下游標(biāo)志基因PTI5、GRAS4、WRKY28和LRR22的表達(dá)增加。Konagaya等[15]在煙草與TMV互作研究中發(fā)現(xiàn)，14-3-3h與N蛋白的富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和病毒解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可提高植株的抗病性。為探究14-3-3-like C在 TMV侵染過程中的生物學(xué)功能，本研究克隆了該基因并對其進(jìn)行初步的功能分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草材料為本氏煙和K326；所用PMD19-T載體、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；植物抑制表達(dá)載體pRNAi-LIC由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑盒購自O(shè)MEGA公司；限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技有限公司；引物合成與測序均由河南尚亞生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 基因克隆

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載基因序列并設(shè)計(jì)引物Nt1433-C-F（5′-CCATGGCGGTGGCACCGACGGCGCGTG-3′）和Nt1433-C-R（5′-CCATGGAATTTTTGGCTTCATCA GG-3′）；以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：模板 1μL，正、反引物各 1μL，2× EsTaqMasterMix 10μL，ddH2O 7μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃終延伸5min，12℃保溫；擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用膠回收試劑盒回收目的條帶，將其與 PMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑取菌斑進(jìn)行PCR檢測，陽性克隆用于測序，測序正確的單克隆菌液于-80℃保存待用。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy網(wǎng)站ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測和分析14-3-3-like C蛋白的理化性質(zhì)；利用 TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對14-3-3-like C蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用Signal-P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對14-3-3-like C蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線工具分析14-3-3-like C蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；利用 MEGA 7.0軟件對包括 14-3-3-like C蛋白在內(nèi)的18個煙草14-3-3蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；利用 WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測 14-3-3-like C蛋白亞細(xì)胞定位；利用 cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預(yù)測核定位序列。

1.4 14-3-3-like C蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位使用的載體為pCAMBIA1302，選擇NcoI和Spe1酶切位點(diǎn)，采用雙酶切的方法，構(gòu)建Nt14-3-3-likeC基因與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的融合表達(dá)載體35S::14-3-3-likeC-GFP，用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28℃震蕩培養(yǎng)（200轉(zhuǎn)/min），當(dāng)OD600為0.6～0.8時，收集50mL菌液并重懸于轉(zhuǎn)染緩沖液，調(diào)節(jié)OD600為1.5，室溫靜置2h，使用注射器將菌液注射到本氏煙葉中，培養(yǎng)3d，取葉片于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.5 抑制表達(dá)載體的構(gòu)建

采用酶切法構(gòu)建抑制載體pRNAi-LIC-14-3-3：使用引物 LIC-1（5′-CGACGACAAGACCCTATGG CGGTGGCACCGACGGCG-3′）與 LIC-2（5′-GAG GAGAAGAGCCCTTCAATTTTTGGCTTCATCAG G-3′）擴(kuò)增目的基因序列，切膠回收得產(chǎn)物1，以其為模板，以 LIC-3（5′-CCAGCACGGAACCCTTGA GGAGAAGAGCCCT-3′）和 LIC-4（5′-AGAGCACA CGACCCTTCGACGACAAGACCCT-3′）為引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)，回收得到產(chǎn)物 2，用限制性內(nèi)切酶SmaI酶切空載體，T4DNA聚合酶處理產(chǎn)物1、2后和空載體用 T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α并涂抗性篩選板。挑取菌斑進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。用凍融法將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，農(nóng)桿菌置于-80℃保存待用。

1.6 組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因苗的鑒定

轉(zhuǎn)入抑制載體 pRNAi-LIC-14-3-3的農(nóng)桿菌于28℃搖床培養(yǎng)（200轉(zhuǎn)/min），當(dāng)OD600約為0.6～0.8時，收集50mL菌液用于煙草葉盤的侵染，將被侵染的煙草葉盤（1.0cm×1.0cm）在含有IAA、6-BA和卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，最終獲得愈傷組織和通過抗性篩選的陽性小芽。

1.7 轉(zhuǎn)基因煙草基因表達(dá)分析

按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，保證所得RNA產(chǎn)物OD260/OD280為1.8～2.1，OD260/OD230大于 1.8；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；使用SYBR Green分析法進(jìn)行熒光定量，所用試劑盒為Fast Super EvaGreen? qPCR Master Mix；儀器為Applied Biosystems ABI 7500實(shí)時定量 PCR儀；PCR 反應(yīng)體系：2× EvaGreen qPCR Master Mix 5.0μL，前、后引物各 0.5μL，cDNA 模板 1.0μL，ROX REFERENCE DYE 0.1μL，ddH2O 2.9μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 5s，72℃ 50s，40個循環(huán)。以煙草Actin為內(nèi)參基因，每個樣品3次重復(fù)，采用-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草Nt14-3-3-like C基因的克隆

提取 K326葉片的總 RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到780bp的特異性條帶（圖1），與預(yù)期的片段大小相符。測序和比對結(jié)果表明，克隆序列與煙草基因組數(shù)據(jù)庫中的Nt14-3-3-likeC基因相似性為98.34%（圖2），說明成功克隆Nt14-3-3-likeC基因。

圖1 Nt14-3-3-like C PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of Nt14-3-3-like C PCR products

圖2 測序序列比對結(jié)果Fig.2 Comparison of sequencing and alignment results

2.2 煙草14-3-3-like C蛋白的生物信息學(xué)分析

ExPASy ProParam在線軟件分析表明，14-3-3-like C蛋白大小為29.36kDa，編碼260個氨基酸；理論等電點(diǎn)pI為4.78；有49個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），32個帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）；不穩(wěn)定系數(shù)為43.39，為不穩(wěn)定蛋白；總疏水性平均系數(shù)為-0.543，為疏水蛋白。TMHMM Server V.2.0和Signal-P4.1軟件對14-3-3-like C蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測結(jié)果（圖3a、b）表明，14-3-3-like C蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)和信號肽，推測該蛋白不是跨膜蛋白和分泌蛋白。NetPhos 3.1 Server的磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果（圖3c）表明，該蛋白含有絲氨酸（10個）、蘇氨酸（4個）和酪氨酸（6個）磷酸化位點(diǎn)，說明該蛋白能被激酶磷酸化。利用SWISS-MODEL軟件對14-3-3-like C蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖3d）表明，14-3-3-like C蛋白具有 14-3-3蛋白的典型溝槽結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能與該蛋白發(fā)揮其功能相關(guān)。

圖3 14-3-3-like C蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of 14-3-3-like C protein

2.3 煙草14-3-3-like C蛋白同源性分析

用MEGA 7.0軟件對包括14-3-3-like C蛋白在內(nèi)的18個煙草14-3-3蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源聚類分析（圖4），發(fā)現(xiàn)14-3-3-like C蛋白與煙草14-3-3 c1和14-3-3 c2親緣關(guān)系最近，說明該蛋白可能具有14-3-3 c1和14-3-3 c2蛋白類似的功能。

圖4 14-3-3-like C同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of 14-3-3-like C

2.4 煙草14-3-3-like C蛋白的亞細(xì)胞定位

通過WoLF PSORT預(yù)測14-3-3-like C蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體，cNLS Mapper預(yù)測 14-3-3-like C具有 1個核定位信號RACNLAKQAFDEAIAELDTLGEESYKDSTLIM，為了確定該蛋白在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建14-3-3-like C蛋白與GFP的融合表達(dá)載體35S::14-3-3-likeCGFP。如圖 5所示，檢測重組載體的菌液，通過PCR成功擴(kuò)增出1條約780bp的特異性條帶，表明融合GFP的14-3-3-like C表達(dá)載體構(gòu)建成功，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌在本氏煙表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)，結(jié)果（圖6）顯示，14-3-3-like C蛋白位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，表明該蛋白可能在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中發(fā)揮一定的作用。

圖5 融合GFP的35S::14-3-3-like C重組表達(dá)載體菌液PCR產(chǎn)物電泳Fig.5 Electrophoretogram of recombinant expression vector 35S::14-3-3-like C-GFP PCR amplification

圖6 14-3-3-like C蛋白亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of 14-3-3-like C

2.5 Nt14-3-3-like C基因抑制表達(dá)載體的構(gòu)建

使用引物L(fēng)IC-1與LIC-2對構(gòu)建的pRNAi-LIC-14-3-3載體進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖7a）顯示，擴(kuò)增的條帶約 480bp，與預(yù)期大小一致。將 2號和3號菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，理論上酶切后有 3條帶，分別為：質(zhì)粒片段9.7kb、酶切片段1（622bp+480bp）和酶切片段2（1053bp+480bp），酶切結(jié)果與理論一致（圖7b），表明抑制表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖7 Nt14-3-3-like C抑制表達(dá)載體的鑒定Fig.7 Identification of Nt14-3-3-like C expression vector

2.6 組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植株鑒定

構(gòu)建成功的抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行煙草組織培養(yǎng)，最終獲得了具有卡那霉素抗性的T0代轉(zhuǎn)化陽性苗（圖8）。提取陽性煙苗葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測外源插入DNA片段，電泳結(jié)果（圖9）表明，擴(kuò)增的目的片段大小為500bp，與引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增序列的大小一致，初步表明Nt14-3-3-likeC抑制載體已成功轉(zhuǎn)入煙草植株中。qPCR從轉(zhuǎn)錄水平檢測陽性植株中Nt14-3-3-likeC基因表達(dá)水平的抑制程度。結(jié)果（圖10）表明，陽性植株中Nt14-3-3-likeC基因表達(dá)成功受到抑制。

圖8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.8 Agrobacterium-mediated genetic transformation

圖9 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測結(jié)果Fig.9 Detection results of transgenic plants

圖10 轉(zhuǎn)錄水平上基因表達(dá)抑制的檢測Fig.10 Detection of gene expression inhibition at transcription level

2.7 轉(zhuǎn)基因煙草基因表達(dá)分析

TMV侵染植物時會誘導(dǎo)病原防衛(wèi)途徑中的基因表達(dá)，侵入植物體內(nèi)后，TMV會破壞植物的光合途徑，因此以野生型K326為對照（CK），通過qPCR分別檢測了CK和Nt14-3-3-likeC基因抑制煙草植株葉片中與病原防衛(wèi)和光合途徑相關(guān)的基因表達(dá)水平。結(jié)果（圖11）顯示，病原防衛(wèi)途徑中的NtN基因（煙草抗病標(biāo)志基因）與NtPR1-a基因（反映植物抗病能力）和光合途徑中的NtPsaA、NtPsbA、NtPetD、NtTIC32、NtGDR、NtOEEp基因表達(dá)量均極顯著下調(diào)，表明Nt14-3-3-likeC基因抑制影響病原防衛(wèi)和光合途徑中的基因表達(dá)。

3 討論

植物在與病原物共同進(jìn)化的過程中逐漸形成了自身的免疫防御系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)進(jìn)行病菌的防治，不僅為抗病基因在結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化等方面的基礎(chǔ)研究提供了重要理論基礎(chǔ)，也為植物病害的防治提供了新思路，因此，植物病原互作越來越受到關(guān)注。植物―TMV病原互作是一種典型的植物―病原互作模式，其互作機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制仍不清楚。本課題組前期在2個對TMV侵染具有不同耐受性的煙草品種中發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白家族中的14-3-3-like C、14-3-3 h1、14-3-3 h2等7個蛋白在不同耐受品種的表達(dá)量均發(fā)生變化[6]，說明14-3-3蛋白在植物響應(yīng)TMV侵染的過程中起著重要作用。越來越多的證據(jù)表明，14-3-3蛋白在植物―病原互作中具有重要作用，但具體的機(jī)制并不清楚。本研究以Nt14-3-3-likeC為候選基因，克隆出Nt14-3-3-likeC基因并對其進(jìn)行初步的功能分析，為進(jìn)一步探究14-3-3-like C蛋白在TMV侵染中的功能奠定了基礎(chǔ)。

序列比對和進(jìn)化樹分析表明，14-3-3-like C與14-3-3 c1和14-3-3 c2同源性最高，說明三者可能具有相似的功能。Malgorzata等[16]研究表明，14-3-3 c1與植物質(zhì)膜H+-ATP酶結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸調(diào)控。14-3-3-like C蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，14-3-3-like C蛋白位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，而生物信息學(xué)分析表明，14-3-3-like C蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，說明14-3-3-like C蛋白不位于細(xì)胞膜上，而是可能與膜蛋白結(jié)合，在細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面行使一定功能，另外，14-3-3-like C也定位于細(xì)胞核，暗示14-3-3還可能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與基因的表達(dá)調(diào)控。Viso等[17]研究表明，14-3-3蛋白和脫落酸調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 ABl3共同結(jié)合于擬南芥后胚胎發(fā)生基因AfEm7和AfEm6的啟動子上，對其轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，在結(jié)合Em基因啟動子的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中，14-3-3蛋白可能作為接頭蛋白發(fā)揮功能。另有研究[18]表明，TMV侵染會破壞光合系統(tǒng)，也會激活植物的病原防衛(wèi)機(jī)制。因此，本研究通過qPCR對轉(zhuǎn)基因材料相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Nt14-3-3-likeC基因抑制材料中，病原防衛(wèi)相關(guān)基因NtN、NtPR-1a和光合途徑相關(guān)基因NtPetD、NtPsbA、NtPsaA、NtTIC32、NtGDR、NtOEEp的表達(dá)水平都顯著下調(diào)，說明Nt14-3-3-likeC基因可能通過抑制植物病原防衛(wèi)和光合途徑相關(guān)基因的表達(dá)參與對 TMV侵染的響應(yīng)。今后我們將通過對T1代植株接種TMV，展開后續(xù)研究，來進(jìn)一步明確14-3-3-like C蛋白在TMV侵染中的功能。本研究為14-3-3蛋白在TMV侵染過程中的生物學(xué)功能和植物―TMV病原互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對TMV的防治具有重要意義。

4 結(jié)論

從煙草K326中成功克隆出Nt14-3-3-likeC基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，14-3-3-like C是一個典型的14-3-3蛋白家族成員，與14-3-3 c1和14-3-3 c2同源關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，14-3-3-like C蛋白位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，說明該蛋白可能在細(xì)胞膜和細(xì)胞核發(fā)揮一定的作用。通過qPCR對轉(zhuǎn)基因材料中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在Nt14-3-3-likeC基因抑制材料中，病原防衛(wèi)相關(guān)基因NtN、NtPR-1a和光合途徑相關(guān)基因NtPetD、NtPsbA、NtPsaA、NtTIC32、NtGDR、NtOEEp表達(dá)水平均極顯著下調(diào)，說明該基因可能通過抑制植物的病原防衛(wèi)和光合途徑的相關(guān)基因表達(dá)參與對TMV侵染的響應(yīng)。