吳華偉，秦義嫻，陳曉春，高金源，鄧 永，劉 丹，蘇 佳，薛青紅，陳延飛

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5，PIV5)為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Para-myxovirinae)腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，可引起犬、貓、豬、牛、倉鼠、豚鼠等多種動物及人呼吸道感染[1-2]?；蚪M大小為15246 nt，在副黏病毒科病毒中最小，遵循“六堿基原則”，其結(jié)構(gòu)式為3'-NP-V/P-M-F-(SH)-HN-L-5'，其中NP、P、L三種蛋白為PIV5病毒粒子的重要組成部分，為核衣殼的裝配和指導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制所必須，相互結(jié)合可形成核糖核蛋白體。L蛋白為多功能大蛋白，含有2256個氨基酸，分子量最大，常用作副粘病毒科遺傳進(jìn)化分析的靶基因或PIV5分子生物學(xué)檢測的靶基因[3-4]。PIV5的檢測方法有病原學(xué)方法(病毒分離、分子生物學(xué)檢測和血凝試驗等)和血清學(xué)方法(包括免疫熒光試驗、中和試驗、血凝抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等)[5]。熒光定量RT-PCR具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短的優(yōu)點，并能有效解決普通PCR污染問題，可作為常見病原核酸的檢測方法。本研究針對PIV5 L基因保守區(qū)域篩選出一對特異性引物和探針，建立了一種特異性檢測PIV5的Taqman熒光定量RT-PCR方法，以期為開展動物源性原輔材料中PIV5污染檢測提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株 PIV5/01株、PIV5/02株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑、試劑盒 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit，Axygen公司產(chǎn)品；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)，TaKaRa公司；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒II型(離心柱型)，Bioteke公司；KOD FX Neo，TOYOBO公司；M-MLV III One-Step qPCR-PCR(Probe)，北京博邁德公司；pEasy Blunt Simple、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品(DL2000)、50×TAE電泳緩沖液，瓊脂糖等，北京全式金公司。

1.3 主要儀器 臺式離心機；旋渦振蕩器；水浴鍋；微量移液器1套(最大量程分別為10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL)。

1.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中副流感病毒5型SER株(JQ743328.1)基因序列，針對L基因序列設(shè)計了一對引物和探針。上游引物(L119-F)：5'-GACCAGAAAATTATTGAAT-3'；下游引物(L119-R)：5'-TACCAGGCACATGTGGGGTT-3'。預(yù)期擴增片段長度為119 bp。探針(L119-P)：5'-FAM-TACTGAGTCGGGCCAAGTAGC-MGB-3'。引物和探針由華大基因公司合成。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的制備 以提取的病毒總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：總RNA 10 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，置70 ℃水浴5 min，冰浴2 min；然后依次加入5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L each) 2 μL、RNase Inhibitor(40 U/μL 0.25μL) 0.5 μL、RTase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL) 0.5 μL、ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系50 μL，其中2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，dNTPs(2 mmol/L each)10 μL，L119-F(10 μmol/L)1.5 μL，L119-R(10 μmol/L)1.5 μL，KOD FX Neo 1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA模板5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，52.9 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，30個循環(huán)；68 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大小為119 bp的目的DNA片段，連接至pEasy Blunt Simple載體，經(jīng)PCR和測序鑒定。質(zhì)?？截悢?shù)計算公式copies/μL=6.02×1023×[質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9÷(堿基數(shù)bp×660)]。

1.6 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用M-MLV III One-Step qPCR-PCR(Probe)說明書中推薦的反應(yīng)體系，對反應(yīng)體系中的引物濃度，探針濃度，退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，以期找到最小的樣本閾值循環(huán)數(shù)和最高熒光值，以及熔解曲線特異、檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好的最佳反應(yīng)條件。

1.6.1 退火溫度的優(yōu)化 熒光定量反應(yīng)體系：One-Step qPCR Buffer(2×)10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μmol/L探針 0.2 μL，病毒RNA 5 μL，補ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃、5 s，溫度梯度(62.0、61.6、60.6、59.2、57.1、55.7、54.7、54.0)℃ 20 s，40個循環(huán)。在延伸時收集熒光信號，報告基因設(shè)置為FAM。

1.6.2引物濃度優(yōu)化 熒光定量反應(yīng)體系：One-Step qPCR Buffer(2×)10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4、0.6、0.8、1.0 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，病毒RNA 5 μL，補ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 5，54.7 ℃ 20 s，40個循環(huán)。在延伸時收集熒光信號，報告基因設(shè)置為FAM。

1.6.3 探針濃度的優(yōu)化 熒光定量反應(yīng)體系：One-Step qPCR Buffer(2×)10 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，2 μmol/L探針(1、2、3、4、5 μL)，病毒RNA 5 μL，補ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，54.7 ℃ 20 s，40個循環(huán)。在延伸時收集熒光信號，報告基因設(shè)置為FAM。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，分別稀釋成1×109～1×101copies/μL共9個梯度，作為模板，進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 特異性試驗 將高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(TJM-F92株)、豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(CH-1R株)、偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、山羊痘活疫苗(AV41株)、小反芻獸疫活疫苗(Clone9株)、豬瘟病毒活疫苗(兔源)、豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、雞新城疫活疫苗(LaSota株)、雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)、鴨瘟活疫苗、雞傳染性法氏囊病活疫苗(NF8株)、雞傳染性法氏囊病活疫苗(D-22株)、雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗(FC-126株)、雞傳染性喉氣管炎活疫苗(K317株)、雞痘鵪鶉化弱毒疫苗、PIV5/01株、牛副流感病毒3型、豬圓環(huán)病毒2型、豬傳染性胃腸炎SCJY-1株、豬流行性腹瀉SCSZ-1株、SIV-H1N1 LN株、SIV-H3N2 HLJ株、雞新城疫病毒Clone30株、新生牛血清、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、胰酶、牛血清白蛋白、蔗糖、脫脂牛奶、明膠、海藻酸鈉等22種獸用生物制品、毒株及原輔材料按商品化核酸提取試劑盒說明書提取RNA或DNA(針對DNA病毒)，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行擴增，以評估所建立方法的特異性。

1.9 敏感性試驗 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋為1×109～1×101copies/μL作為模板，用建立的副流感病毒5型TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法進(jìn)行敏感性檢測。將測定好病毒含量的PIV5/02株10倍系列稀釋后作為模板，提取RNA后用建立的副流感病毒5型TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法進(jìn)行敏感性檢測。

1.10 重復(fù)性試驗 以1×108～1×106copies/μL稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個濃度的樣品做3次重復(fù)，計算變異系數(shù)。分析所建立的熒光定量RT-PCR檢測方法的可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增和陽性重組質(zhì)粒的鑒定 以制備的PIV5的cDNA為模板，對PIV5 L基因進(jìn)行PCR擴增，大小為119 bp，與預(yù)期大小一致，結(jié)果見圖1。目的片段陽性的重組質(zhì)粒測序分析結(jié)果表明，成功構(gòu)建了L基因的pEasy Blunt Simple陽性重組質(zhì)粒。

2.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 最佳退火溫度的確定 由圖2可知，退火溫度為54.7 ℃時，熒光定量擴增得到最小的Ct值及最高熒光值，確定為熒光定量反應(yīng)的最佳退火溫度。

M：DL2000；1-7：L基因PCR產(chǎn)物；8：陰性對照M：DNA Marker；1-7：PCR-amplified L gene；8：Negative control圖1 PIV5 L基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒的鑒定Fig 1 PCR amplification of L gene and identification of the recombinant plasmid

圖2 最佳退火溫度Fig 2 The optimal annealing temperature

2.2.2 最適引物濃度的確定 以退火溫度為54.7 ℃進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，最佳反應(yīng)條件以得到最小的Ct值及最高熒光值為指標(biāo)，最適引物濃度為0.5 μmol/L(圖3)。

圖3 最適引物濃度Fig 3 The optimum primer concentration

2.2.3 最適探針濃度 在確定最適退火溫度和引物濃度的條件下，探針濃度為0.1 μmol/L時，熒光定量擴增得到最小的Ct值及最高熒光值，確定為熒光定量反應(yīng)的最適探針濃度(圖4)。

圖4 最適探針濃度Fig 4 The optimum probe concentration

經(jīng)過試驗條件的優(yōu)化，最終確定了最佳熒光定量PCR的反應(yīng)條件：One-Step qPCR Buffer(2×)10 μL；酶0.6 μL；上游引物(10 μmol/L)1 μL；下游引物(10 μmol/L)1 μL；探針(10 μmol/L) 0.1 μL；模板5 μL；ddH2O 2.3 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，54.7 ℃ 20 s，40個循環(huán)(PCR擴增)。在54.7 ℃延伸時收集熒光信號，報告基因設(shè)置為FAM。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋為1×109～1×101copies/μL 作為模板，以優(yōu)化的特異性引物、探針、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示具有良好的線性關(guān)系。擴增效率E=92.6%，R2=0.995，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.514X+41(圖5)。

圖5 L基因熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve of Taqman fluorescent quantitative RT-PCR for L gene

2.4 特異性試驗 選取了PIV5/01株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(TJM-F92株)、豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(CH-1R株)等22種獸用生物制品、毒株及原輔材料，用建立的方法，進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴增，結(jié)果顯示除PIV5/01株外，其他樣品均未檢測到特異性擴增信號(圖6)，說明所建立的檢測方法具有良好的特異性。

圖6 PIV5 L基因熒光定量RT-PCR的特異性試驗Fig 6 The specificity test of the Taqman fluorescent quantitative RT-PCR for PIV5 L gene

2.5 敏感性試驗 以10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按優(yōu)化好的熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴增，其最小檢出模板濃度為10 copies(圖7)。將測定好病毒含量的PIV5/02株進(jìn)行10倍系列稀釋后作為模板，進(jìn)行敏感性檢測，其最小檢出量為0.8 TCID50(圖8)。

圖7 敏感性分析的擴增曲線Fig 7 Amplification plots of the sensitivity test

從左到右：分別代表800、80、8、0.8、0.08、0.008 TCID50PIV5/02株以及陰性對照的擴增曲線The curves from left to right represent 800、80、8、0.8、0.08、0.008 TCID50 PIV5/02 strain and negative control圖8 對PIV5/02株檢測靈敏度試驗結(jié)果Fig 8 Amplification plots of the PIV5/02 strain

2.6 重復(fù)性試驗 如表所示，不同模板濃度其變異系數(shù)均小于1.5%，表明所建立的熒光定量RT-PCR檢測方法具有良好的穩(wěn)定性(表1)。

表1 穩(wěn)定性試驗Tab 1 Stability test of the Taqman fluorescentquantitative RT-PCR for L gene

3 討 論

PIV5是近年來獸用生物制品用細(xì)胞和牛血清外源病毒檢驗中新發(fā)現(xiàn)的外源病原[6]，具有血凝特性，可在Vero等細(xì)胞引起典型細(xì)胞病變，可作為該病原診斷的參考方法。目前用于診斷該病的方法有病毒分離鑒定、血清學(xué)方法和PCR等，上述方法存在費時、操作繁瑣、無法定量等缺點，影響了對該病原的質(zhì)量控制，成為目前獸用生物制品質(zhì)量的潛在威脅，所以亟需建立一種特異、敏感、快速、簡便、可定量檢測PIV5的實時熒光RT-PCR方法，作為獸用生物制品企業(yè)加強動物源性材料控制的內(nèi)控方法。國內(nèi)已有商品化的PIV5熒光定量檢測試劑盒，但大多都是染料法和兩步法，為此本研究根據(jù)PIV5保守基因L基因進(jìn)行設(shè)計一對特異性引物和一條探針，成功建立了一種一步法Taqman熒光定量RT-PCR檢測方法，對PIV5 L基因重組質(zhì)粒和PIV5/02株的最低檢測限分別為10 copies和0.8TCID50，對22種常見豬病病毒、牛羊病病毒、禽病病毒和各種原輔材料均無交叉。在驗證熒光定量檢測方法的特異性時，DNA病毒直接提取DNA進(jìn)行熒光定量檢測，RNA病毒需要先提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄然后再進(jìn)行熒光定量檢測。該方法顯示出良好的敏感性和特異性，有望為保障我國獸用生物制品質(zhì)量提供重要技術(shù)支撐。