張英楠，徐 晶，張桂山，楊樹(shù)寶 , 3*

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院， 吉林吉林 132013；2. 長(zhǎng)春科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130600；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

刺五加多糖(ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫機(jī)能、抗氧化、抗腫瘤和抗感染等功效[1-2]。結(jié)合刺五加的功效及其安全、綠色和環(huán)保的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于養(yǎng)殖過(guò)程中具有重要意義。

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，機(jī)體在抗原刺激下，通過(guò)致敏和反應(yīng)階段，T淋巴細(xì)胞分化為效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，從而抵抗體內(nèi)外各種病原菌的感染[3]。T淋巴細(xì)胞兩個(gè)重要的表面標(biāo)志是CD4和CD8，其中CD4+T淋巴細(xì)胞的主要功能是分泌細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，CD8+T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞毒殺傷作用。CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的樞紐，在正常值范圍內(nèi)當(dāng)CD4+/CD8+值高時(shí)，表明機(jī)體處于高的免疫狀態(tài)，當(dāng)CD4+/CD8+的比例失調(diào)或缺陷時(shí)，可導(dǎo)致各種免疫疾病發(fā)生[4]。

研究證明，植物多糖能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，尤其是對(duì)于維持CD4+/CD8+值的正常范圍具有重要作用[5-7]。另外，這些研究主要是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)血液中的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化進(jìn)行檢測(cè)，而目前關(guān)于ASPS對(duì)雞T淋巴細(xì)胞亞群定位分布的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ASPS對(duì)雞脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞定位分布的影響，從組織學(xué)角度觀察ASPS對(duì)脾臟的免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步探討ASPS的免疫功能調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 200只1日齡海蘭褐公雛，購(gòu)自長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種雞場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 刺五加多糖由本實(shí)驗(yàn)提取和純化，多糖純度為 81%[8]；冰凍切片用OCT組織包埋液：美國(guó)Sakura公司產(chǎn)品；小鼠抗雞CD4、CD8單克隆抗體：美國(guó)Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901：福州邁新公司產(chǎn)品。

Leica CM1850 冰凍切片機(jī)：德國(guó)Leica公司生產(chǎn)；Olympus CX41 顯微鏡：日本Olympus公司生產(chǎn)；Pixera pro150ES圖像采集器：美國(guó)Pixera公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物分組與處理 1日齡海蘭褐公雛飼養(yǎng)至7日齡時(shí)選取150只，隨機(jī)分為3組，每組50只。第1組和第2組為ASPS低劑量組和高劑量組，分別用ASPSL和ASPSH表示，兩組分別皮下注射100 mg/mL和200 mg/mL的ASPS；第3組為空白對(duì)照組，注射等量滅菌生理鹽水。所有組每天注射1次，ASPS和生理鹽水均為0.2 mL，連續(xù)注射3 d。

每一組分別在最后一次注射ASPS后的第7、14、21和28天取材，每組分別隨機(jī)選取10只雛雞，快速取其脾臟。將脾臟制成冰凍切片，片厚5 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆?，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1. 4 免疫組織化學(xué)染色程序 每組每只雞隨機(jī)選取5張切片，每張切片依次滴加30 mL/L過(guò)氧化氫(室溫下孵育10 min)、小鼠抗雞CD4(1∶200)或CD8(1∶200)單克隆抗體工作液(37 ℃孵育1 h)、聚合物增強(qiáng)劑(室溫下孵育20 min)和酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(室溫下孵育30 min)；每一種試劑孵育后，均用PBS洗3次，每次3 min；最后DAB顯色；蘇木精復(fù)染；自來(lái)水沖洗返藍(lán)；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)脂封片；照相。

1. 5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測(cè)定脾臟中單位視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞面積。每張切片測(cè)3個(gè)視野，取平均值。應(yīng)用SPSS18.0軟件對(duì)各組陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD4+T淋巴細(xì)胞定位分布的變化情況

圖1- A，B，C，D顯示，空白對(duì)照組隨著日齡增長(zhǎng)，脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，除免疫后7 d明顯低于其他日齡外，其他各日齡之間差異不明顯，各日齡CD4+T淋巴細(xì)胞主要分布在動(dòng)脈周圍淋巴鞘中，其他部位以散在形式存在。

免疫后7 d和14 d時(shí)ASPSL組和ASPSH組CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量均有所增加，但與空白對(duì)照組比較差異并不顯著(P>0.05)，而免疫后21 d和28 d時(shí)顯著增加(P<0.05)(圖2)。從免疫后14 d開(kāi)始，主要由CD4+T淋巴細(xì)胞構(gòu)成的動(dòng)脈周圍淋巴鞘面積較空白對(duì)照組明顯增加，尤其是免疫后21 d和28 d時(shí)，單個(gè)動(dòng)脈周圍淋巴鞘面積大概是同日齡對(duì)照組的3倍左右(圖1-G，H)，但是此階段紅髓中CD4+T淋巴細(xì)胞較同日齡對(duì)照組和同組之前日齡明顯減少(圖1-G，H)。

2.2 CD8+T淋巴細(xì)胞定位分布的變化情況

圖1- I，J，K，L顯示，各組各日齡CD8+T淋巴細(xì)胞都主要分布在紅髓和白髓中，動(dòng)脈周圍淋巴鞘中較少，沒(méi)有較大面積的由CD8+T淋巴細(xì)胞構(gòu)成的動(dòng)脈周圍淋巴鞘出現(xiàn)，空白對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量免疫后7 d和14 d變化較小，但是免疫后21 d時(shí)明顯增加。

與對(duì)照組比較，除了免疫后28 d ASPSH組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加外(P<0.05)，其他各日齡ASPSL組和ASPSH組CD8+T淋巴細(xì)胞雖有所增加，但是差異均不顯著(P>0.05)(圖2)，而且CD8+T淋巴細(xì)胞的定位分布與同日齡對(duì)照組比較也無(wú)大的變化，陽(yáng)性細(xì)胞都主要分布在紅髓和白髓中，而動(dòng)脈周圍淋巴鞘中陽(yáng)性細(xì)胞較少(圖1-M，N，O，P)。

2.3 CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的變化情況 表1顯示，免疫后7 d和14 d時(shí)，ASPSL組和ASPSH組CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值與空白對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d和28 d時(shí)，ASPSL組和ASPSH組CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值為1.1左右，均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，但兩個(gè)ASPS組之間比較差異并不顯著(P>0.05)。

表1 各組雞CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比值的動(dòng)態(tài)變化Tab 1 The dynamic changes of the rario of CD4+/CD8+T lymphocytes in different groups

圖A-D分別顯示免疫后7、14、21和28 d空白對(duì)照組CD4+ T淋巴細(xì)胞分布；圖E-H分別顯示免疫后7、14、21和28 dASPSH組CD4+ T淋巴細(xì)胞分布；圖I-L分別顯示免疫后7、14、21和28 d空白對(duì)照組CD8+ T淋巴細(xì)胞分布；圖M-P分別顯示免疫后7、14、21和28天ASPSH組CD8+ T淋巴細(xì)胞分布注：圖中細(xì)箭頭所示為動(dòng)脈周圍淋巴鞘，粗箭頭所示為紅髓中陽(yáng)性細(xì)胞A-D are respectively the distribution of CD4+ cells in control group of 7, 14, 21 and 28 days after immunization; E-H are respectively thedistribution of CD4+ cells in ASPSH group of 7, 14, 21 and 28 days after immunization; I-L are respectively the distribution of CD8+ cells incontrol group of 7,14, 21 and 28 days after immunization; M-P are respectively the distribution of CD8+ cells in ASPSH group of 7, 14, 21 and28 days after immunizationNote: The thin arrows indicate PALS, while the thick arrows indicate positive cells in the red pulp圖1 ASPS對(duì)脾臟中CD4+ 和CD8+ T淋巴細(xì)胞定位分布的影響(250×)Fig 1 The effect of ASPS on distribution of CD4+and CD8+T lymphocytes in spleen (250×)

注：同一日齡肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)Different letters of shoulder label indicated significant difference (P<0.05), while the same letter ofshoulder label indicated no significant difference (P>0.05).圖2 ASPS對(duì)脾臟中CD4+ 和CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響Fig 2 The effect of ASPS on quantity of CD4+ and CD8+T lymphocytes in spleen

3 討論與結(jié)論

T、B淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群體，分別調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答, 是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。多糖能調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞周期，刺激其分裂增殖，并促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子和抗體的分泌[8]。ASPS可激活NK(自然殺傷) 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并對(duì)T、B細(xì)胞產(chǎn)生重要作用，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[9]。Lee等[10]還發(fā)現(xiàn), 刺五加多糖能夠與TLR4受體以及CD14結(jié)合，進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)IL-1β，IL-6，IL-10和TNF-α的產(chǎn)生。Han等人[11]發(fā)現(xiàn)，ASPS能夠與與TLR2或TLR4相互作用，能夠激活小鼠的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，并且進(jìn)一步活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、MAPK，然后調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子如TNF-α，IL-6，iNOS等，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。目前多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)主要通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖能力以及相關(guān)細(xì)胞因子等方法進(jìn)行的，另外對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的觀察主要是利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，但是關(guān)于多糖對(duì)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在免疫器官及組織中的精確定位變化還未見(jiàn)報(bào)道，這對(duì)于進(jìn)一步揭示多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。

脾臟作為雞體內(nèi)的最大的外周免疫器官對(duì)T依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答是通過(guò)動(dòng)脈周圍淋巴鞘和橢球周圍淋巴鞘之間的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的[12]。本文前期研究證明ASPS能夠明顯促進(jìn)由CD3+T淋巴細(xì)胞構(gòu)成的動(dòng)脈周圍淋巴鞘和由Bu-1+B淋巴細(xì)胞過(guò)程的橢球周圍淋巴鞘的發(fā)育[8]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞是構(gòu)成動(dòng)脈周圍淋巴鞘的主要T淋巴細(xì)胞亞群，與對(duì)照組比較，ASPSL組和ASPSH組位于紅髓和白髓中散在的CD4+T淋巴細(xì)胞減少，而動(dòng)脈周圍淋巴鞘中CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，從而使動(dòng)脈周圍淋巴鞘的面積明顯增加。這說(shuō)明在ASPS作用下，CD4+T淋巴細(xì)胞在脾臟中發(fā)生遷移，主要募集到動(dòng)脈周圍淋巴鞘周圍，并進(jìn)一步增殖，具體原因和機(jī)理還需要以后進(jìn)一步研究。由于CD4+細(xì)胞可以產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，參與或協(xié)助細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，ASPS能夠促進(jìn)脾臟中CD4+細(xì)胞的數(shù)量增加，另外影響其在脾臟的定位分布，都是增強(qiáng)免疫的表現(xiàn)。

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ASPS對(duì)脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及定位分布影響較小，與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。另外，免疫后21和28天時(shí)，與空白對(duì)照組比較，ASPS能夠顯著提高CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值(P<0.05)。因此在ASPS作用下，脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞增多以及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高，證明脾臟免疫功能得到進(jìn)一步提高。這也與其他學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的結(jié)果基本一致：邱妍等[13]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合適劑量的黃芪、板藍(lán)根、牛膝和山藥等4種多糖均可以促進(jìn)雞CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫。此外，雞CD4+T 淋巴細(xì)胞還具有輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用，從而提高體液免疫。王宏軍等[14]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)貴州南五味子多糖明顯促進(jìn)正常雞體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖，CD4+細(xì)胞百分比升高，CD8+細(xì)胞百分比下降，CD4+/CD8+細(xì)胞比值升高。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)川明參多糖能夠提高環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的CD4+/CD8+細(xì)胞比值，使其比值恢復(fù)至正常水平。因此，中藥多糖對(duì)于改善和維持T淋巴細(xì)胞亞群的正常范圍具有重要作用。

ASPS雖然對(duì)脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和分布無(wú)明顯影響，但對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的定位分布影響較大，能夠促進(jìn)紅髓中CD4+T淋巴細(xì)胞向動(dòng)脈周圍淋巴鞘遷移，使動(dòng)脈周圍淋巴鞘面積增加，這從組織學(xué)角度證明ASPS能夠通過(guò)影響CD4+T淋巴細(xì)胞的定位分布發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。