夏經(jīng)緯 陳羽中 溫少迪 杜曉月 沈波

根據(jù)國際癌癥研究機構編制的GLOBOCAN的2020年最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計，肺癌仍是全球癌癥相關死亡的首位病因，每年有18%的肺癌患者死亡，而非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）發(fā)病率約占所有肺癌患者的80%‐85%，且大多數(shù)患者診斷時已是晚期，晚期患者的5年生存率更是僅為19%[1]。目前以程序性死亡受體1（programmed cell death 1,PD‐1）/程序性死亡配體1（programmed cell death‐ligand 1,PD‐L1）免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）為代表的免疫治療對NSCLC患者具有顯著的療效。KEYNOTE‐001研究[2]報道的一線接受Pembrolizumab治療的晚期NSCLC患者5年總生存率為23.2%。ICIs單藥或聯(lián)合治療已成為驅動基因陰性晚期NSCLC患者的一線標準治療。然而免疫治療可能帶來嚴重的免疫相關不良反應，因此，準確有效的生物標志物對于確定免疫治療是否能夠獲益十分關鍵。目前，PD‐L1和腫瘤突變負荷（tumor mutation burden,TMB）仍然是預測NSCLC免疫治療療效的最常見的生物標志物，還有許多潛在的預測性生物標志物，包括微生物組、腫瘤浸潤淋巴細胞、基因標志、多組學等[3]。但是這類生物標志物檢測方法較為復雜、費用昂貴、耗時久，這限制了它們的臨床應用。因此需要可以簡易獲取的生物標志物來選擇免疫治療的潛在受益人群。

近年來，炎癥反應在腫瘤微環(huán)境中的重要作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中炎癥因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移中起重要作用，如白細胞介素‐6（interleukin‐6,IL‐6），腫瘤壞死因子‐α（tumor necrosis factor‐α,TNF‐α）和轉化生長因子‐β（transforming growth factor‐β,TGF‐β）等[4]。在諸多炎癥指標中，中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil‐to‐lymphocyte ratio,NLR）、血小板與淋巴細胞比值（platelet‐to‐lymphocyte ratio,PLR）被證實與惡性腫瘤有明顯的相關性，可為預后提供重要的信息[5‐9]。然而基線值以及治療后不同時期數(shù)值的臨床意義仍有爭議，因此，我們進行了一項回顧性研究，分析外周血炎癥標志物對晚期NSCLC患者免疫治療療效和生存預后的預測價值。具體包括：中性粒細胞計數(shù)（absolute neutrophil counts,ANC）、淋巴細胞計數(shù)（absolute lymphocyte counts,ALC）、血小板計數(shù)（platelet count,PLT）、中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil‐to‐lymphocyte ratio,NLR）及血小板與淋巴細胞比值（platelet‐lymphocyte ratio,PLR）。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2018年10月‐2019年8月于中國南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院接受抗P D‐1 治療（Pembrolizumab、Sintilimab或Toripalimab）的173例晚期NSCLC患者。所有患者均符合以下標準：入組標準：①病理學明確診斷為NSCLC；②初診時臨床分期為不可手術III期或IV期；③接受過抗PD‐1免疫治療（單藥或聯(lián)合方案）；④病歷資料完整，存在可評估療效的影像學資料。排除標準：①1個月內(nèi)出現(xiàn)炎癥性疾病或接受手術；②近期使用過類固醇藥物；③治療期間發(fā)生嚴重副反應，如骨髓抑制、肝功能受損等；④出現(xiàn)重度貧血、營養(yǎng)不良。

最終納入符合標準患者173例，其中抗PD‐1單藥方案44例，聯(lián)合化療方案83例，聯(lián)合抗血管生成藥物方案18例，聯(lián)合化療和抗血管生成藥物方案28例。

通過電子病歷或電話隨訪收集患者的臨床病理特征，包括治療時的年齡、性別、病理類型、腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結‐轉移（tumor‐node‐metastasis,TNM）分期[10]、東部合作腫瘤小組評分（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）、驅動基因突變類型、吸煙史、治療線數(shù)等。分別于治療前、治療后第6周和第12周（0 w、6 w、12 w）收集患者的血液學指標，包括ANC、ALC、PLT、NLR以及PLR。本研究由江蘇省腫瘤醫(yī)院機構評審委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方案 具體治療方案如下：單藥方案患者每3周接受一次Pembrolizumab靜脈注射固定劑量200 mg，Sintilimab靜脈注射固定劑量200 mg，或Toripalimab靜脈注射固定劑量240 mg。聯(lián)合化療為含鉑雙藥化療，其他藥物根據(jù)腫瘤組織學確定，包括培美曲塞、多西紫杉醇、紫杉醇/白蛋白紫杉醇、吉西他濱。聯(lián)合抗血管生成藥物為貝伐珠單抗。其中存在一部分具有EGFR突變患者，其PD‐1抑制劑免疫治療的使用均為晚期后線治療。

1.2.2 療效評價及隨訪 通過電子病歷以及電話隨訪獲得數(shù)據(jù)，隨訪起止時間為2018年10月1日‐2020年12月10日。治療后每6周‐8周進行一次全身電子計算機斷層掃描（computed tomography,CT），根據(jù)實體瘤的評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumour 1.1,RECIST1.1）標準評估患者對治療的療效，分為完全緩解（complete response,CR）、部分緩解（partial response,PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）和疾病進展（progressive disease,PD）。以客觀緩解率（objective response rate,ORR）和疾病控制率（disease control rate,DCR）評價療效，以無進展生存期（progression‐free survival,PFS）和總生存期（overall survival,OS）評價生存率。ORR定義為CR和PR之和，DCR定義為CR、PR和SD之和。PFS定義為從初始治療到臨床或影像學進展或死亡的時間，OS定義為從初始治療到最后一次隨訪或死亡的時間。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8.3.0以及R等統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)中位數(shù)結合既往研究及相關文獻，NLR截斷值取3，PLR截斷值取160[11‐13]。使用χ2檢驗及Logistic回歸多因素分析確定影響DCR及ORR的顯著變量。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，繪制OS及PFS曲線，并采用Log-rank檢驗對生存曲線進行組間比較。采用Cox比例風險模型確定PFS、OS的預后因素?；贑ox多因素分析結果，構建列線圖，并使用自舉重采樣（bootstrap resampling）進行驗證，利用一致性指數(shù)（c‐index）以及校準曲線評估預測模型的準確性。運用單因素分析對預后因素初篩，變量篩選的檢驗水準設為α=0.10，即把單因素分析P<0.10的因素納入多因素回歸分析。P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 基線資料 共173例患者納入研究，6例患者2個周期治療后因副反應明顯、死亡或其他不明原因未能繼續(xù)后續(xù)治療，其余167例患者均完成4個周期及以上的治療并有可評估療效的影像學資料。中位年齡為64歲；男性134例（77.5%），女性39例；65.9%的患者為非鱗癌；79.8%的患者為IV期患者；97.7%患者ECOG評分為0分‐1分，只有4例患者ECOG評分為2分；33例患者攜帶EGFR基因突變；62.4%的患者有吸煙史；初治患者67例（38.7%），復治患者106例（61.3%）；其中接受過放療的患者占45.7%；使用Pembrolizumab、Sintilimab和Toripalimab的患者數(shù)分別為75例（43.4%）、79例（45.7%）和19例（11.0%）；25.4%（44/173）的患者接受單藥方案，幾乎一半患者（48.0%）接受ICIs聯(lián)合化療方案治療，10.4%（18/173）患者接受ICIs聯(lián)合抗血管生成藥物方案，16.2%（28/173）患者接受ICIs聯(lián)合化療、抗血管生成藥物方案治療（表1）。患者各階段實驗室檢查結果詳見表2。

表1 173例患者的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of 173 patients

2.2 療效評價 隨訪時間截至2020年12月10日，全組患者中位隨訪時間為19.70（14.88‐24.52）個月。如表2所示，173例患者中，無人達到CR，48例達到PR，107例達到SD，18例PD。ORR和DCR分別為27.7%（48/173）和89.6%（155/173）。

表2 173例患者的實驗室檢查結果、治療反應及生存Tab 2 Laboratory tests and scores,response to treatment and survival of 173 patients

如表3所示，通過χ2檢驗分析影響療效的因素，結果顯示年齡、吸煙、治療線數(shù)、NLR12w影響DCR，年齡、NLR0w、NLR6w、NLR12w與ORR相關。隨后的多因素Logistic回歸分析顯示，年齡≥64（OR=4.141,95%CI:1.304‐13.146）和NLR12w<3（OR=6.567,95%CI:1.392‐30.975）與更高的DCR相關；年齡≥64（OR=2.175,95%CI:1.093‐4.330），NLR6w<3（OR=2.827,95%CI:1.369‐5.838）和NLR12w<3（OR=2.393,95%CI:1.178‐4.860）與更高的ORR顯著相關。

表3 非小細胞肺癌患者療效與臨床因素的相關分析Tab 3 Associations between response to treatment and clinical factors in patients with non-small cell lung cancer

2.3 生存分析 總人群的中位PFS及OS分別為8.3個月（95%CI:7.491‐9.109）和15.5個月（95%CI:14.087‐16.913）。對PFS及OS分別進行單因素與多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)ECOG評分0‐1組患者PFS較長（HR=0.196,95%CI:0.070‐0.550,P=0.002），接受放療可以降低患者的疾病進展風險（HR=0.602,95%CI:0.413‐0.877,P=0.008），單藥方案也顯示出更好的控制疾病進展的能力（HR=0.489,95%CI:0.303‐0.787,P=0.003），NLR6w≥3（HR=1.882,95%CI:1.296‐2.732,P=0.001）和NLR12w≥3（HR=1.536,95%CI:1.048‐2.251,P=0.028）組患者疾病進展風險較高；EGFR突變組（HR=1.956,95%CI:1.127‐3.395,P=0.017），NLR0w≥3組（HR=1.700,95%CI:1.119‐2.584,P=0.013），NLR6w≥3組（HR=1.719,95%CI:1.129‐2.616,P=0.012）以及NLR12w≥3組（HR=2.015,95%CI:1.319‐3.079,P=0.001）患者死亡風險更高，詳見表4、表5。

表5 非小細胞肺癌患者OS單因素與多因素Cox回歸分析Tab 5 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS in all patients with non-small cell lung cancer

根據(jù)Cox回歸發(fā)現(xiàn)的影響預后的因素分組繪制相應的生存曲線圖1、圖2。發(fā)現(xiàn)NLR6w<3的患者PFS顯著長于NLR6w≥3的患者（P<0.001），NLR12w<3組的患者相較于NLR12w≥3組也同樣有更長的PFS（10.8個月vs7.3個月，P=0.02），接受放療或者單藥方案的患者的無進展生存期更長（P=0.007,2,P=0.002,5）。接受ICIs單藥治療的患者多為一線初治患者，這類患者往往有著更加良好的早期療效。ECOG評分為2的患者無進展生存期較短（4.15個月vs8.5個月，P<0.001），僅有4例患者ECOG評分為2，樣本量較少，可能對最終結果有所影響。在OS方面，不論檢測時間，NLR<3組均顯示出OS的臨床獲益。無基因突變患者相較于有EGFR突變患者有更長的OS（15.7個月vs15.3個月，P=0.035），這一結果也與目前大多數(shù)大型研究一致，顯示出攜帶基因突變患者免疫治療療效的局限性。

圖1 PFS的Kaplan-Meier生存分析。A：用藥6周后，按NLR分組的患者無進展生存期的Kaplan-Meier生存曲線；B：用藥12周后，按NLR分組的患者無進展生存期的Kaplan-Meier生存曲線；C：按ECOG評分分組的患者無進展生存期的Kaplan-Meier生存曲線；D：按患者有無放療分組的無進展生存期的Kaplan-Meier生存曲線；E：不同用藥方案的無進展生存期的Kaplan-Meier生存曲線。Fig 1 Kaplan-Meier survival analysis for PFS.A:Kaplan-Meier survival curves for progression-free survival in patients grouped by NLR after 6 weeks of dosing;B:Kaplan-Meier survival curves for progression-free survival in patients grouped by NLR after 12 weeks of dosing;C:Kaplan-Meier survival curves for progression-free survival in patients grouped by ECOG PS;D:Kaplan-Meier survival curves for progression-free survival in patients grouped by radiotherapy;E:Kaplan-Meier survival curves for progression-free survival in patients grouped by option of treatment.

圖2 OS的Kaplan-Meier生存分析。A：用藥前，按NLR分組的患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線；B：用藥6周后，按NLR分組的患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線；C：用藥12周后，按NLR分組的患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線；D：按是否存在EGFR突變分組的患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis for OS.A:Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients grouped by NLR before dosing;B:Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients grouped by NLR after 6 weeks of dosing;C:Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients grouped by NLR after 12 weeks of dosing;D:Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients grouped by EGFR mutation.

2.4 列線圖評分 基于Cox多因素分析結果，構建列線圖預測6個月和12個月的無進展生存率及總生存率。NLR6w及NLR12w分組預測無進展生存率的c指數(shù)分別為0.640及0.629；NLR0w、NLR6w及NLR12w分組預測總生存率的c指數(shù)分別為0.603、0.607及0.595。并且各個分組的校準曲線圖顯示出良好的一致性（圖3、圖4）。

圖3 預測6個月及12個月無進展生存率的列線圖及校準曲線圖。A：ECOG評分和NLR6w的列線圖；B：NLR6w預測6個月和12個月PFS概率的校準曲線；C：ECOG評分和NLR12w的列線圖；D:NLR12w預測6個月和12個月PFS概率的校準曲線。Fig 3 Nomogram predicting the probability of 6-months and 12-months progression-free survival (PFS) and calibration plots.A:A nomogram incorporating the presence of ECOG and NLR6w;B:Calibration curve for predicting the probability of 6-months and 12-months PFS using NLR6w;C:A nomogram incorporating the presence of ECOG and NLR12w;D:Calibration curve for predicting the probability of 6-months and 12-months PFS using NLR12w.ECOG PS_group:0=PS 0-1,1=PS 2;NLR6w_group:0=NLR6w<3,1=NLR6w≥3;NLR12w_group:0=NLR12w<3,1=NLR12w≥3;Treatment_option:0=monotherapy,1=combination therapy;Radiotherapy:0=no radiotherapy,1=receiving radiotherapy.

圖4 預測6個月及12個月總生存率的列線圖及校準曲線圖。A：基因突變類型和NLR0w的列線圖；B：NLR0w預測6個月和12個月OS概率的校準曲線；C：基因突變類型和NLR6w的列線圖；D：NLR6w預測6個月和12個月OS概率的校準曲線；E：基因突變類型和NLR12w的列線圖；F：NLR12w預測6個月和12個月OS概率的校準曲線。Fig 4 Nomogram predicting the probability of 6-months and 12-months OS and calibration plots.A:A nomogram incorporating the presence of gene mutation and NLR6w;B:Calibration curve for predicting the probability of 6-months and 12-months OS using NLR6w;C:A nomogram incorporating the presence of gene mutation and NLR6w;D:Calibration curve for predicting the probability of 6-months and 12-months OS using NLR6w;E:A nomogram incorporating the presence of gene mutation and NLR12w;F:Calibration curve for predicting the probability of 6-months and 12-months OS using NLR12w.Gene_group:0=non-EGFR mutation,1=EGFR mutation;NLR0w_group:0=NLR0w<3,1=NLR0w≥3;NLR6w_group:0=NLR6w<3,1=NLR6w≥3;NLR12w_group:0=NLR12w<3,1=NLR12w≥3.

3 討論

眾所周知，對于晚期NSCLC患者，ICIs相對于傳統(tǒng)化療有更顯著的療效獲益[14‐16]，但是由于免疫治療可能帶來嚴重的不良反應，因此，預測使用ICIs的患者的療效尤為重要。病理類型、PD‐L1表達水平、TMB和腫瘤浸潤淋巴細胞等可以有效地預測免疫治療療效，然而這些標記的檢測方法較為復雜，并且只能反應某一個固定時間段的特征，無法實現(xiàn)動態(tài)預測，因此，通過常規(guī)實驗室檢查指標來預測免疫治療療效就顯得尤為重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，炎癥反應發(fā)揮著不同的作用，并且其對腫瘤的免疫治療反應有所影響，調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）具有免疫抑制功能，在腫瘤組織中聚集，在炎癥反應中，這些細胞也被樹突狀細胞募集和激活[17]。骨髓來源的抑制性細胞（myeloid‐derived suppressor cells,MDSCs）亦屬于促炎細胞，它被炎癥反應激活，并向特定部位聚集，促進血管形成，同時它也具有免疫抑制作用[18]。因此，腫瘤相關性炎癥通過產(chǎn)生促炎和抗炎信號，導致腫瘤生長并逃避免疫監(jiān)視。中性粒細胞、淋巴細胞等炎癥標志物在此過程中發(fā)揮關鍵作用[19]。

在本回顧性研究中，我們評估了173例符合條件的NSCLC患者的臨床特征和預后，并通過分析可能與NSCLC相關的外周血炎癥相關指標（ANC、ALC、PLT、NLR、PLR等）對患者的預后進行預測。與既往部分研究不同的是，本研究根據(jù)不同時期的NLR、PLR數(shù)據(jù)構建了多個模型，從而可以動態(tài)地預測患者的療效及生存。最終我們的數(shù)據(jù)顯示NLR與患者預后密切相關，具體來講，NLR12w<3的患者有更好的DCR，NLR6w和NLR12w<3的患者ORR更高并且有更長的PFS，在OS方面，不管何時，NLR<3的患者的OS都更長。

既往諸多研究表明NLR、PLR等指標對NSCLC患者使用免疫治療的預后有預測價值，且大部分研究表明基線的數(shù)值更有預測價值[20‐23]。Capone等[24]的研究發(fā)現(xiàn)基線NLR≥5的接受免疫治療的惡性黑色素瘤患者的OS和PFS顯著低于NLR <5的患者；Bartlett等[25]的研究也顯示出基線NLR≥5與較短的OS相關（HR=2.0;95%CI:1.3‐2.9）。而在本研究中，我們根據(jù)基線、治療后6周以及12周三個時間段的NLR及PLR值預測患者的預后，然而我們并沒有發(fā)現(xiàn)PLR在預測療效及生存方面的價值，也沒有發(fā)現(xiàn)基線NLR在患者免疫治療療效以及PFS方面的預測價值，只在預測OS方面發(fā)現(xiàn)基線NLR具有預測價值。可能的解釋是，本研究納入患者以復治患者居多，這類患者前期的化療方案可能對免疫治療前所測定的標志物的基線值有所影響。在PFS方面，我們發(fā)現(xiàn)接受過放療的患者往往有更加良好的PFS獲益，提示放療在患者早期獲益中的重要地位，但是對OS并沒有影響，這可能是由于本研究樣本量相對較少，有一定的局限性。需要注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，接受ICIs單藥治療的患者有著更長的PFS，這可能是因為單藥治療的患者以一線初治患者為主，而這類患者往往有著更好的早期獲益可能。在OS方面發(fā)現(xiàn)了基線NLR的預測價值可能是因為在NLR0w<3分組中，初治患者居多，這類患者免疫治療進展后往往有更多后續(xù)治療方案的選擇，因此總生存期可以得到延長。為了評估本研究中的預測模型的準確性，我們還構建了列線圖、計算一致性指數(shù)并繪制了校準曲線?？梢园l(fā)現(xiàn)本研究中的預測模型的一致性指數(shù)及校準曲線均顯示出統(tǒng)計學意義。

本研究的不足之處主要是本研究為單中心研究，患者樣本量有限，不同時期NLR的預后價值有待擴充病例數(shù)后進一步驗證。此外，本研究的隨訪時間尚短，因此后續(xù)需要更長的隨訪時間來探索不同時期NLR對于生存預后的價值。最后，血液學指標的變化可能僅為化療引起，需要只接受化療的患者為對照組，然而，我們無法招募足夠數(shù)量的患者，因為在目前的臨床實踐中單獨化療方案十分少見，后續(xù)將繼續(xù)進行相關研究，建立驗證隊列。盡管有著如上局限性，但是免疫細胞在反應腫瘤免疫治療時機體免疫炎癥狀態(tài)的作用仍不容忽視，這也是進行本研究的機制背景[26‐28]。參照諸如NLR等簡易實驗室指標的動態(tài)變化進行免疫治療方案的選擇可能是未來的一個研究方向。

綜上所述，不同時期的NLR可能是一種可以預測NSCLC患者免疫治療療效的臨床生物標志物，并且其具有簡易獲取、動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢。未來可以通過更大樣本量的研究進一步探索NLR等相關指標在NSCLC患者中的應用價值，為臨床醫(yī)生提供更方便有效的參考依據(jù)。

Author contributions

Xia JW,Chen YZ and Shen B conceived and designed the study.Xia JW,Wen SD,Du XY and Shen B analyzed the data.Xia JW,Chen YZ,Wen SD,Du XY and Shen B contributed analysis tools.Xia JW,Chen YZ and Shen B provided critical inputs on design,analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.