張 博，楊 俊，馮 志，李 強(qiáng)，呂良康，任 瑩,2，趙勝軍,2*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

適宜含量和比例的揮發(fā)性脂肪酸（VFA）構(gòu)成是保證腸道正常和穩(wěn)定的前提之一[1]。有研究表明，大腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的VFA 可維持體液和電解質(zhì)平衡，為宿主提供能量[2]。其中，乙酸可穿過血腦屏障，通過其穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)食欲[3-4]；乙酸和丙酸可以直接激活G 蛋白偶聯(lián)受體[5]；丁酸是腸道細(xì)胞的關(guān)鍵能量來源，還能促進(jìn)胃排空以及維持腸道黏膜的屏障作用，也可以抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，降低結(jié)腸癌和結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。

豬大腸發(fā)酵產(chǎn)生的一部分VFA 在腸道被吸收，供機(jī)體利用，未被吸收利用的則隨著大腸內(nèi)容物以糞便形式排出體外。因此，測(cè)定豬大腸VFA 的產(chǎn)生量首先要了解VFA 在體內(nèi)的去向。Douglas 等[9]利用同位素示蹤技術(shù)研究結(jié)腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的VFA 產(chǎn)量與全身VFA 通量的關(guān)系，結(jié)果表明[2H]-VFA 和[13C]-VFA 可用于測(cè)量機(jī)體VFA 通量，且方法簡(jiǎn)單精準(zhǔn)。Markantonatos 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用[13C]-VFA 作為示蹤劑可準(zhǔn)確獲得穩(wěn)態(tài)條件下荷斯坦母牛瘤胃的VFA 代謝信息。故基于VFA 在豬大腸吸收和利用的重要性，本試驗(yàn)推測(cè)可利用 [13C]-VFA 穩(wěn)定性同位素灌注法，跟蹤豬大腸內(nèi)產(chǎn)生的VFA 的去向，獲得豬體內(nèi)的VFA 代謝信息。目前有關(guān)豬血液、大腸組織和大腸內(nèi)容物中[13C]-VFA 的測(cè)定方法未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)豬血液、大腸組織和大腸內(nèi)容物中[13C]-VFA 含量進(jìn)行分析研究，并對(duì)該方法進(jìn)行精準(zhǔn)性驗(yàn)證，為該方法廣泛應(yīng)用于研究大腸VFA 利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料 同位素對(duì)照品乙酸（1-13C）、丙酸（1-13C）、丁酸（1-13C）標(biāo)準(zhǔn)品為廣州譜恩科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品為阿拉丁化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；超純水為武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

用超純水與乙酸、丙酸、丁酸、乙酸（1-13C）、丙酸（1-13C）和丁酸（1-13C）配制相同濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為儲(chǔ)備液。然后經(jīng)超純水稀釋得到100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為中間儲(chǔ)備液。

1.2 儀器與設(shè)備 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B-5977B，美國(guó)），配備有電子轟擊（EI）電離源和四級(jí)桿質(zhì)量分析儀，配有7693A 和7650A 進(jìn)樣器，G1701FA 工作站；萬分之一天平（Ohaus AR2140，美國(guó)）；KQ5200 超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；優(yōu)普超純水機(jī)（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 上機(jī)條件 Agilent DB-FFAP 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：高純氦氣（He），純度＞99.999%；升溫程序條件：初始溫度50℃，保持1 min，以10℃/min升至200℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比2:1；電離方式：EI；電子能量：-70 eV；電子倍增器電壓：0.954 kV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿：150℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍：33～200 m/z。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集 選取1 頭30 kg 左右體況良好的生長(zhǎng)豬，預(yù)試3 d 玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧后，對(duì)其手術(shù)安裝回腸末端“T”型瘺管。待其恢復(fù)正常采食后，前期以24 mL/h 的速度灌注5 min，后期以5.7 mL/h 的速度從“T”型瘺管處灌注3 種[13C]-VFA（乙酸、丙酸、丁酸），灌注持續(xù)至5 h。灌注結(jié)束后采集血液，裝入預(yù)先加了數(shù)滴肝素（300 IU/mL）的離心管中，立即將離心管置于冰瓶中送至實(shí)驗(yàn)室離心，離心后分裝于1 mL 小管中，密封并于-20℃保存。采血后按畜類屠宰要求屠宰，采集大腸的盲腸、結(jié)腸、直腸3 段完整腸道以及內(nèi)容物并稱重，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩? 段腸道按質(zhì)量比取樣，內(nèi)容物混勻取樣，待檢測(cè)。

1.4.2 樣品前處理 將血漿樣品在4℃下融解，充分混勻，取500 μL 于EP 管中，加入2 mL 超純水進(jìn)行稀釋，在常溫條件下利用超聲波清洗機(jī)超聲30 min 進(jìn)行混均，并經(jīng)過0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過濾后保存，待檢測(cè)。按質(zhì)量比精密稱取-80℃凍存的3 段大腸腸道組織樣品共0.5 g 于研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，研磨粉碎后置于燒杯中，加入超純水溶解并稀釋至25 倍，利用超聲波清洗機(jī)超聲30 min 進(jìn)行混勻，混勻后8 000 r/min 離心30 min，取上清液經(jīng)過0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過濾后保存，待檢測(cè)。精密稱取解凍過后的-80℃凍存大腸混合內(nèi)容物共0.5 g 于燒杯中，加入超純水溶解并稀釋至400 倍，利用超聲波清洗機(jī)超聲30 min 進(jìn)行混勻，8 000 r/min 離心30 min，取上清液經(jīng)過0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過濾后保存，待檢測(cè)。

1.5 線性回歸方程、線性范圍及檢出限 以1.1 中6 種揮發(fā)性脂肪酸的濃度為100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為中間儲(chǔ)備液，用超純水逐步稀釋得到1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。上機(jī)前以0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過濾，按照1.3 中上機(jī)條件進(jìn)行分析。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。選擇目標(biāo)物3 倍信噪比的濃度為其檢出限。

1.6 方法的精密度、準(zhǔn)確度和回收率考察 配制10、30、50 μg/mL 3 個(gè)濃度梯度的6 種對(duì)照品VFA 各4 份，每天配制1 批，持續(xù)做3 d，分別在日內(nèi)和日間按1.3中上機(jī)條件上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定4 次，按照其峰面積代入線性方程計(jì)算相應(yīng)濃度，計(jì)算其日內(nèi)和日間變異系數(shù)，考察所建立方法的精密性；以血液、大腸組織和腸道內(nèi)容物為供試品，平行取樣3 份，按1.4.2 進(jìn)行樣品處理后，按照1.3 中上機(jī)條件測(cè)定，考察所建立方法的重復(fù)性；以10、30、50 μg/mL 3 種濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)為供試品，上機(jī)前以0.22 μm 的有機(jī)系微孔濾膜過濾，按照1.3 中上機(jī)條件測(cè)定，重復(fù)測(cè)定4 次，考察所建方法樣品回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限考察 由表1 可知，乙酸、丙酸、丁酸含量分別在1～100、5～100、10～100 μg/mL 線性關(guān)系良好；同位素標(biāo)記的乙酸、丙酸、丁酸含量分別在10～100、10～100、10～100 μg/mL線性關(guān)系良好，6 種VFA 相關(guān)系數(shù)R2最小值為0.9904，檢出限分別為0.15～1.18 μg/mL。

表1 不同標(biāo)準(zhǔn)VFA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢出限

2.2 方法的精密度與重復(fù)性 由表2 可知，低中高3 種濃度的6 種VFA 日內(nèi)精密度在0.06%～9.6%，6 種VFA日間精密度在2.21%～8.18%，且各目標(biāo)物保留時(shí)間不超過0.5%，符合方法學(xué)要求。方法的重復(fù)性考察結(jié)果表明，血液樣品中6 種VFA 濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.72%～3.95%；大腸組織中6 種VFA 濃度的RSD在2.69%～7.38%；大腸內(nèi)容物中6 種VFA 濃度的RSD在0.88%～3.53%；且3 種樣品6 種VFA 的保留時(shí)間的RSD 均不超過0.5%。

表2 GC-MS 測(cè)定[12C]-VFA 和[13C]-VFA 的精密度

2.3 方法的回收率 方法的回收率考察結(jié)果如表3 所示，對(duì)于非同位素?fù)]發(fā)性脂肪酸，乙酸的回收率在90.76%～104.17%，丙酸回收率在70.42%～97.88%，丁酸的回收率在71.75%～119.00%；對(duì)于同位素標(biāo)記的VFA，乙酸回收率在92.88%～126.36%，丙酸回收率在89.15%～110.20%，丁酸回收率在73.23%～114.68%。

表3 6 種VFA 的回收率

2.4 血液、大腸組織和腸道內(nèi)容物中6 種VFA 含量的測(cè)定 將血液、大腸組織和腸道內(nèi)容物樣品經(jīng)1.4.2 處理后，按1.3 條件上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)得出3 種樣品色譜圖如圖1、2、3 所示。找出6 種VFA 對(duì)應(yīng)的色譜峰，根據(jù)特征離子定量積分得到相應(yīng)的峰面積，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出相應(yīng)的VFA 含量如表4。

表4 血液、大腸組織和腸道內(nèi)容物中6 種VFA 含量

圖1 血液樣品中VFA 色譜圖

圖2 大腸組織樣品中VFA 色譜圖

圖3 腸道內(nèi)容物中VFA 色譜圖

3 討 論

短鏈脂肪酸（SCFAs）是結(jié)腸腔中的重要有機(jī)酸，可為結(jié)腸提供能量支持[11]。腸道中的SCFAs 主要是由大腸中未吸收的膳食碳水化合物經(jīng)厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生的[12]；產(chǎn)生的SCFAs 大部分被盲腸和結(jié)腸快速吸收，只有5%～10% 存在于糞便、血液和尿液中[13]。進(jìn)入腸上皮細(xì)胞和肌肉組織的VFA 被轉(zhuǎn)化成酮體以及CO2用于供能。研究表明，VFA 可為豬生長(zhǎng)需要提供5%～25%的能量[14]。人們通常采用氣相色譜和液相色譜與各種檢測(cè)器（如折射率、紫外線、火焰離子化、質(zhì)譜等）相結(jié)合的方法測(cè)定VFA 含量，這些測(cè)定方法多用于尿液、血液、糞便和結(jié)腸內(nèi)容物等樣品中，在動(dòng)物腸道組織樣中的應(yīng)用較少[15-19]。液相色譜通常用于檢測(cè)液體樣品中VFA 含量，氣相色譜更常用于測(cè)定腸道內(nèi)容物等固體樣品中VFA 含量。由于乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs 對(duì)紫外和折射率檢測(cè)器的信號(hào)響應(yīng)通常很弱，因此本研究利用[13C]-VFA 作為示蹤劑，準(zhǔn)確地跟蹤VFA 在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)去路。通過測(cè)定[13C]-VFA 各去向的相對(duì)量，從而有效地獲取豬大腸中VFA 的代謝利用信息。本試驗(yàn)中各目標(biāo)物在檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，6 種VFA檢出限在線性范圍最高為100 μg/mL，而當(dāng)濃度高于該上限值時(shí)，測(cè)定結(jié)果依然滿足其標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此，今后可對(duì)其線性范圍進(jìn)行進(jìn)一步拓展與優(yōu)化；且本試驗(yàn)單個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間只需要16 min，快速簡(jiǎn)便，并且可用于測(cè)定腸道組織中VFA 含量。但是根據(jù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可看出，[13C]-VFA 占總VFA 的比值均在5%以上，說明試驗(yàn)中[13C]-VFA 的灌注量偏高，有可能對(duì)機(jī)體正常代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響。因此，為減少同位素灌注過量帶來的試驗(yàn)誤差，在今后對(duì)VFA 進(jìn)行定量研究時(shí)，可以適當(dāng)降低[13C]-VFA 的灌注量。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種用于豬血液、大腸組織和大腸內(nèi)容物中[13C]-VFA 和[12C]-VFA 含量的測(cè)定方法，6 種VFA 濃度的日間與日內(nèi)RSD 均小于10%，且保留時(shí)間不超過0.5%。,6種VFA 線性方程相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上，檢出限在0.15～1.18 μg/mL，加標(biāo)回收率在70.42%～126.36%。該方法可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速，可用于準(zhǔn)確測(cè)定豬血液、大腸組織和大腸內(nèi)容物中[13C]-VFA 與[12C]-VFA 含量，為廣泛應(yīng)用于研究大腸VFA 利用與動(dòng)向提供理論依據(jù)。