王 彤，劉 倩，嚴(yán) 慧，紀(jì)守坤，劉 萱，朱美玉，王亞越，劉月琴，張英杰

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000）

腸道微生物在刺激新生反芻動(dòng)物腸道免疫系統(tǒng)建立[1]、參與宿主免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[2]，在動(dòng)物后腸段營養(yǎng)物質(zhì)降解利用方面也具有重大意義，羊盲腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸占總產(chǎn)量的12%[3]。細(xì)菌作為腸道菌數(shù)量最大的一類，其多樣性極高，目前已分離鑒定的細(xì)菌包括53 個(gè)門、26 024 個(gè)種[4]，腸道細(xì)菌群落受飼料[5-6]、飼養(yǎng)方式[7]、季節(jié)[8]和遺傳[9]等多因素影響，不同研究中所獲得的群落多樣性各異，導(dǎo)致研究者對(duì)羊腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)知產(chǎn)生爭議。Smith 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢物種在維護(hù)生物群落穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，動(dòng)物胃腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌往往會(huì)決定動(dòng)物機(jī)體的采食[11]和免疫[12]等功能，也更容易在腸道中定植生存。因此，腸道中的優(yōu)勢菌群可能也在維護(hù)腸道微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，對(duì)羊腸道優(yōu)勢菌群進(jìn)行研究對(duì)其腸道微生態(tài)調(diào)控具有重要意義。

Chang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，羊腸道菌以密螺旋體屬（Treponema）為絕對(duì)優(yōu)勢屬，其次有琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）和5-7N15。Zhang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊腸道以擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Rumi nococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostri dium）和黃桿菌屬（Flavonifractor）為主。研究結(jié)果的差異可能與動(dòng)物個(gè)體差異及樣本過少等因素有關(guān)，羊腸道具有普適參考性的優(yōu)勢菌類型及其豐度區(qū)間仍不明確。

Meta 分析能夠有效綜合同一研究內(nèi)容的不同獨(dú)立研究結(jié)果，利用系統(tǒng)定量的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)已發(fā)表文獻(xiàn)中的同類數(shù)據(jù)進(jìn)行合并分析，獲得全面性的結(jié)論，已形成一套嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牧鞒?，在醫(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。因此，本研究采用網(wǎng)狀文獻(xiàn)檢索和Meta 分析法結(jié)合，通過對(duì)大量文獻(xiàn)的豐富數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到羊腸道優(yōu)勢菌群的有效豐度區(qū)間，從而達(dá)成系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)和描述羊腸道優(yōu)勢菌群及其豐度區(qū)間的目的，為羊腸道常駐優(yōu)勢菌的研究提供有力的證據(jù)和合理的參考。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索與篩選標(biāo)準(zhǔn) 研究對(duì)象為健康羊的優(yōu)勢菌群種類和豐度。采用中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）和Web of Science 2 個(gè)平臺(tái)，并通過追查已納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。檢索時(shí)間區(qū)間為建庫到2021 年3 月5 日。在中國知網(wǎng)等中文數(shù)據(jù)庫中，以主題詞“羊”、“腸道”、“菌群結(jié)構(gòu)”、“菌群”、“微生物”、“消化道”和“腸道細(xì)菌”進(jìn)行檢索。在Web of Science 外文數(shù)據(jù)庫中，以主題詞“sheep”、“Goat”、“Lamb”、“Bacterial Community”、“Intestinal Tract”、“Intestinal Flora”和“Microbiota”進(jìn)行檢索。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入指標(biāo)：①英文和中文文獻(xiàn)；②結(jié)局指標(biāo)：菌群種類、數(shù)量、豐富度與多樣性；③試驗(yàn)動(dòng)物為斷奶后的羊。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①只能獲取摘要且無法與作者獲得聯(lián)系的文獻(xiàn)；②研究對(duì)象不符合的特殊樣本（哺乳期羔羊；瘤胃菌群；小腸菌群）；③數(shù)據(jù)不全的文獻(xiàn)（結(jié)果和附表中只有圖或文字表述，未給出門或者屬的具體豐度信息；未給出SD、SE 或SEM值）；④未公開發(fā)表，重復(fù)報(bào)道或信息不完整的文獻(xiàn)；⑤綜述、個(gè)案報(bào)道或基礎(chǔ)研究等類型的相關(guān)文獻(xiàn)。

1.3 資料提取 由研究者進(jìn)行資料的提取并反復(fù)核對(duì)，信息提取由研究特征、研究對(duì)象的特征和結(jié)局指標(biāo)3 部分組成，包括作者、發(fā)表時(shí)間、實(shí)驗(yàn)方法、研究對(duì)象類別、樣本量、試驗(yàn)組、對(duì)照組、微生物豐度、標(biāo)準(zhǔn)誤等。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用R-4.0.0 軟件進(jìn)行方差倒數(shù)法Meta分析，合并效應(yīng)量為微生物豐度，計(jì)算合并之后的點(diǎn)估計(jì)值及95%的可信區(qū)間（CI）。若原始數(shù)據(jù)只提供中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差SD 及樣本量N，通過公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤SE。利用I2和P 進(jìn)行綜合判斷是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性，P＞0.1，I2＜50%，表示存在同質(zhì)性或異質(zhì)性很小，采用固定效應(yīng)模型；P＜0.1，I2＞50%，表示存在較大異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。使用R-4.0.0 軟件繪制漏斗圖評(píng)價(jià)發(fā)表偏倚，Thompson 算法計(jì)算偏倚顯著性，P＜0.05，不對(duì)稱漏斗形表明可能存在發(fā)表偏倚；P＞0.05，對(duì)稱的漏斗形則表示不存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果與分析

2.1 文獻(xiàn)檢索和篩選 本研究經(jīng)過初步檢索共獲得相關(guān)文獻(xiàn)1 413 篇，在簡單閱讀摘要后剔除重復(fù)文獻(xiàn)和不符合要求的文獻(xiàn)640 篇，通過閱讀文章內(nèi)容，排除602 篇（包括文獻(xiàn)綜述43 篇，觀察性實(shí)驗(yàn)108 篇，菌種致病研究234 篇，治療方案201 篇，會(huì)議、報(bào)紙等16 篇），獲得38 篇文獻(xiàn)，閱讀試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果，進(jìn)一步剔除不符合要求的文獻(xiàn)23 篇（包括結(jié)局指標(biāo)不符的文獻(xiàn)14 篇，主要試驗(yàn)動(dòng)物不符的文獻(xiàn)3 篇，敘述性文章5 篇），最終獲得12 篇文獻(xiàn)（包含7 篇中文文獻(xiàn)，5 篇英文文獻(xiàn)），納入Meta 分析。

2.2 納入文章的基本特征 納入12 篇文獻(xiàn)，共包括233只試驗(yàn)羊。所有納入文獻(xiàn)均提到隨機(jī)分組，本研究關(guān)注的產(chǎn)出指標(biāo)為優(yōu)勢菌群豐度，納入的12 篇文獻(xiàn)中，包含門類水平優(yōu)勢菌的有10 篇，包含屬類水平優(yōu)勢菌的有10 篇，文獻(xiàn)信息見表1。

表1 12 篇羊腸道菌群文章信息

2.3 門水平優(yōu)勢菌豐度 如表2 所示，羊腸道以厚壁菌門和擬桿菌門為絕對(duì)優(yōu)勢門，豐度點(diǎn)估計(jì)值分別為56.76%和28.64%，95%置信區(qū)間分別為（53.70%，59.81%）和（25.15%，32.13%）。螺旋體門豐度點(diǎn)估計(jì)值為2.37%，變形菌門為2.06%，放線菌門為0.69%。

2.4 屬水平優(yōu)勢菌豐度 羊腸道優(yōu)勢菌屬豐度及95%置信度區(qū)間見表2。擬桿菌屬是羊腸道的優(yōu)勢菌屬，豐度點(diǎn)估計(jì)值為4.33%，95%置信區(qū)間為（3.13%，5.53%）。密螺旋體屬豐度點(diǎn)估計(jì)值為2.49%，瘤胃球菌屬為1.60%，普氏菌屬為0.67%，丁酸弧菌屬為0.30%。

表2 羊腸道優(yōu)勢門和屬的meta 分析結(jié)果

2.5 發(fā)表偏倚評(píng)估 如圖1 所示，羊腸道擬桿菌門和厚壁菌門豐度指標(biāo)漏斗圖對(duì)稱性好，P值分別為0.16 和0.90，不存在發(fā)表偏倚，其他菌群豐度指標(biāo)均存在發(fā)表偏倚。

圖1 羊腸道優(yōu)勢門和屬豐度的偏倚評(píng)估

3 討 論

因飼料、環(huán)境、測序等因素影響，對(duì)羊腸道的優(yōu)勢菌群一直存在爭議，在門水平，多項(xiàng)研究表明厚壁菌門和擬桿菌門均為優(yōu)勢門前兩位[24-25]，且均落在本研究結(jié)果變異范圍內(nèi)，本研究中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度信息不存在發(fā)表偏倚，說明結(jié)果具有良好的代表性，且該兩個(gè)門的微生物在羊腸道中的豐度非常穩(wěn)健，不易受其它因素?cái)_動(dòng)。擬桿菌門屬于革蘭氏陰性菌，Parnell 等[26]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門的豐度與體脂和體重呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，擬桿菌門細(xì)菌基因組中富含大量碳水化合物活性酶基因[27]，能夠利用多種膳食可溶性多糖，覆蓋藻類、植物、動(dòng)物等多種來源的底物，代謝產(chǎn)物以乙酸鹽和丙酸鹽為主[28-29]。擬桿菌門細(xì)菌具有多種產(chǎn)維生素和輔酶的基因[30]，可能在羊腸道微生物消化和營養(yǎng)利用中發(fā)揮重要作用。厚壁菌門屬革蘭氏陽性菌，利用宏基因組研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門細(xì)菌富含生物合成及膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因[31]，丁酸鹽產(chǎn)量較高，也能產(chǎn)生多種B 族維生素[32]，幼齡動(dòng)物攝入固體食物后厚壁菌門細(xì)菌豐度逐漸提高[32]，隨著年齡增長，腸道厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著升高[33]，厚壁菌門豐度升高可能與抗炎和改善腸道屏障相關(guān)[34]，但研究發(fā)現(xiàn)過高的厚壁菌門/擬桿菌門比值與2 型糖尿病或肥胖相關(guān)[29,35]，羊斷奶后腸道以厚壁菌門類群為主，可能也與年齡增長或機(jī)體腸道免疫的建立有關(guān)。變形菌門、螺旋體門和放線菌門的優(yōu)勢地位在各項(xiàng)研究中并不穩(wěn)定，原因一方面與實(shí)驗(yàn)中使用的羊只數(shù)量有限（3～6只）有關(guān)[14,24,36-37]；另一方面，可能與這部分菌的發(fā)酵特異性有關(guān)，受日糧、環(huán)境等因素影響較為強(qiáng)烈。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包含著名的機(jī)會(huì)病原菌，如大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等[38]，其豐度升高往往伴隨腸道炎癥的發(fā)生；大多數(shù)變形菌門細(xì)菌不是致病菌，也可編碼大量蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝基因，對(duì)于維持腸道的厭氧環(huán)境起著重要作用[38]。螺旋體門細(xì)菌的功能相對(duì)研究較少，Ni 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸桿菌和雙歧桿菌制劑能夠顯著提高螺旋體門細(xì)菌的豐度。放線菌門雖然占比較小，但其可能在維持羊腸道穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用，尤其是雙歧桿菌被廣泛用作益生菌制劑[40]。目前為止，人們對(duì)不同門水平菌的功能認(rèn)知還很有限，對(duì)于菌間協(xié)同或拮抗、細(xì)菌與宿主互作等方面均有待深入研究。

擬桿菌屬和普氏菌屬都屬于擬桿菌門，是腸型判定的重要依據(jù)，兩者產(chǎn)短鏈脂肪酸的能力差異較大，普氏菌腸型比擬桿菌腸型產(chǎn)丙酸能力高出2～3 倍[41]，這可能與兩者碳水化合物降解酶系不同有關(guān)[42]。本研究表明，羊斷奶后以擬桿菌腸型為主，對(duì)擬桿菌屬和普氏菌屬進(jìn)行干預(yù)可能實(shí)現(xiàn)對(duì)羊腸道微生物發(fā)酵類型的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬的菌株可促進(jìn)宿主免疫T 細(xì)胞的功能完善[43]，還可參與結(jié)腸神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)節(jié)[44]，Yoshida[45]發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬的菌株可以減少腸道微生物脂多糖的產(chǎn)生，有效抑制促炎性免疫反應(yīng)。而普氏菌可參與宿主免疫調(diào)節(jié)[46]，與多種炎癥性疾病有關(guān)[47]，腸普雷沃氏菌的定植可能加劇宿主腸道炎癥[48]，對(duì)羊腸道擬桿菌/普氏菌穩(wěn)態(tài)的調(diào)控對(duì)機(jī)體免疫及健康養(yǎng)殖也具有重要意義。密螺旋體屬的細(xì)菌包含致病菌[49]，但密螺旋體屬細(xì)菌屬于動(dòng)物腸道原著菌，是城市化生活的人腸道中逐漸丟失的特殊類群[50]。密螺旋體屬作為羊腸道中的優(yōu)勢菌，其與羊斷奶后采食的高碳水型飼料密切相關(guān)，這與Zhou 等[51]報(bào)道的豬腸道密螺旋體屬細(xì)菌富含大量多糖降解酶基因的結(jié)果相符。瘤胃球菌屬菌株最早在牛瘤胃中被發(fā)現(xiàn)，具有降解纖維素的能力[52]，瘤胃球菌屬也富含多種植物多糖水解酶基因[53-54]，在腸道微生態(tài)平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[55]。丁酸弧菌是半纖維素降解優(yōu)勢菌[56]，發(fā)酵可產(chǎn)丁酸，淀粉、果膠、木聚糖等多種多糖物質(zhì)[57]均可作為其底物，其在羊腸道中可能參與降解消化道前端未完全消化的多糖或半纖維素。

本研究經(jīng)P和I2綜合檢驗(yàn)顯示納入文獻(xiàn)存在有異質(zhì)性，原因是：①試驗(yàn)羊品種和年齡差異；②日糧差異；③羊生理狀態(tài)、環(huán)境差異。除擬桿菌門和厚壁菌門豐度不存在發(fā)表偏倚，其他菌群豐度均存在一定程度的發(fā)表偏倚。螺旋體門的偏離值來自于Lin 等[23]在2021 年的報(bào)道，對(duì)照組使用低精料飼喂湖羊，螺旋體門豐度為27.21%，飼喂高精料后螺旋體門豐度顯著下降至6.97%，這可能由日糧精粗比導(dǎo)致。Thingholm 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，城市化的生活方式使得人腸道中螺旋體門細(xì)菌豐度降低。螺旋體門可能是較易受日糧結(jié)構(gòu)影響的菌群，隨著相關(guān)研究的不斷積累，在未來研究中有必要基于日糧不同精補(bǔ)比水平對(duì)腸道螺旋體門豐度進(jìn)行亞組分析，分別評(píng)估其水平。密螺旋體屬的偏離值原因同螺旋體門，可能隨日糧精粗比波動(dòng)較大，其他菌群的偏倚性可能均與研究樣本量的限制等因素相關(guān)，未來還需要深入研究加以驗(yàn)證。

羊腸道細(xì)菌群落受宿主遺傳[9]、自身生理狀態(tài)[59]、生存環(huán)境[60]和日糧結(jié)構(gòu)[5]等因素影響，其中最主要的影響因素是日糧結(jié)構(gòu)[61]，腸道微生物的生長和繁殖歸根結(jié)底來自于對(duì)營養(yǎng)元素的競爭和消耗[62-63]，本研究結(jié)果反映了當(dāng)前飼養(yǎng)模式下，羊腸道優(yōu)勢門和屬類別及豐度水平，數(shù)據(jù)量樣本的擴(kuò)大突破了試驗(yàn)研究中樣本量小的限制，基于大樣本分析得到羊腸道優(yōu)勢門屬類別及合理的豐度參考范圍，為羊腸道微生物結(jié)構(gòu)特征研究和腸道菌群微生態(tài)調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考，為羊腸道菌群的腸型判定提供理論依據(jù)，未來使用大樣本基礎(chǔ)測序數(shù)據(jù)的重分析細(xì)化研究仍有待深入開展。

4 結(jié) 論

本研究通過Meta 薈萃分析解析羊大腸腸段的優(yōu)勢菌群及其豐度參考范圍，結(jié)果顯示門水平上，羊腸道細(xì)菌優(yōu)勢門依次為厚壁菌門（Firmicutes）56.76%、擬桿菌門（Bacteroidetes）28.64%、螺旋體門（Spirochaetes）2.37%、變形菌門（Proteobacteria）2.06% 和放線菌門（Actinobacteria）0.69%；屬水平上，羊腸道細(xì)菌優(yōu)勢屬依次為擬桿菌屬（Bacterodies）4.33%、密螺旋體屬（Treponema）2.49%、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）1.60%、普氏菌屬（Prevotella）0.67% 和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）0.30%，擬桿菌門細(xì)菌富含大量碳水化合物活性酶基因，能產(chǎn)多種維生素和輔酶，在羊腸道中發(fā)揮重要作用，普氏菌屬和擬桿菌屬均屬于擬桿菌門，是腸型判定的重要依據(jù)，羊腸道以擬桿菌腸型為主。試驗(yàn)結(jié)果為羊腸道后端菌群健康調(diào)控和科學(xué)研究提供了理論依據(jù)。