陶 林，賀小云，江炎庭，楊紅遠(yuǎn)，洪瓊花*，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

產(chǎn)羔性狀是山羊生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀。產(chǎn)羔數(shù)和產(chǎn)羔窩重（初生窩重、斷奶窩重）是衡量母羊生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，但其遺傳機(jī)制尚不清楚。因此，相關(guān)候選位點(diǎn)的發(fā)掘?qū)ι窖蚍肿訕?biāo)記輔助選擇育種具有重要意義。間隙連接（Gap Junction）是動(dòng)物細(xì)胞通訊的三大方式之一，在各種生理功能（如代謝偶聯(lián)、神經(jīng)信息沖動(dòng)傳遞和胚胎早期發(fā)育）中具有重要意義。間隙連接的基本單位是連接子（Connexon），由6 個(gè)相同或相似的間隙連接蛋白（Connexin，Cx）組成[1]。Cx 是一個(gè)同源蛋白家族，老鼠中有20 個(gè)成員，人中有21 個(gè)成員[2]。前期研究表明，Cx 在女性健康中具有非常重要的作用，其影響的過程包括早期性別分化、卵子發(fā)生、胚胎附植、脫膜化和胚胎發(fā)育等[1,3-6]。間隙連接蛋白26（Cx26，也被稱為GJB2）在綿羊的卵巢上皮細(xì)胞、間質(zhì)及其內(nèi)的血管、黃體中表達(dá)[7]。GJB2 免疫定位于各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞、次級(jí)和竇狀卵泡的顆粒層、卵泡膜層、基質(zhì)和血管中[8]。因此，Cx 可能在綿羊卵子發(fā)生、卵泡閉鎖、黃體生長(zhǎng)、分化和退化中起到重要作用。

課題組前期的重測(cè)序數(shù)據(jù)表明，GJB2和GJB6（編碼間隙連接蛋白30，Cx30）在高繁殖力云上黑山羊群體中受到了強(qiáng)烈的正選擇。但目前山羊的多羔候選基因主要借鑒綿羊多羔候選基因和生殖激素相關(guān)基因[9-11]，未見Cx 家族基因在山羊繁殖性狀的相關(guān)報(bào)道。因此，推測(cè)GJB2和GJB6可能影響山羊產(chǎn)羔性能。本研究旨在分析GJB2和GJB6在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊群體中的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)羔性能的關(guān)聯(lián)，以期為山羊分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和表型記錄 本研究共采集了768 只母羊（2～5 歲，544 只云上黑山羊、133 只濟(jì)寧青山羊和91只遼寧絨山羊）的頸靜脈血液（10 mL/只），用酚-氯仿法提取基因組DNA。云上黑山羊是以云嶺黑山羊?yàn)槟副?、努比山羊?yàn)楦副九嘤傻奈覈?guó)第一個(gè)肉用黑山羊品種[12-14]。云上黑山羊來源于云南紅河哈尼族彝族自治州，擁有至少1 胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有產(chǎn)羔窩重和斷奶窩重（3 月齡）記錄。濟(jì)寧青山羊來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部濟(jì)寧青山羊保種基地（山東省嘉祥縣），遼寧絨山羊來源于遼寧絨山羊育種中心（遼寧省遼陽市）。濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊沒有具體產(chǎn)羔數(shù)記錄。本研究將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體，將遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[15-16]。

1.2 基因分型 利用MassARRAY?技術(shù)對(duì)GJB2和GJB6基因候選位點(diǎn)（GJB2g.50675977G＞A、GJB2g.50676288T＞C、GJB6g.50694816A＞G 和GJB6g.50694819G＞A）進(jìn)行分型。相關(guān)引物信息見表1。具體分型方法見參考文獻(xiàn)[17]。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 群體遺傳參數(shù)利用在線工具（http://www.msrcall.com/Gdicall.aspx）計(jì)算。本研究利用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)和探索候選位點(diǎn)基因型與品種（高繁品種：濟(jì)寧青山羊；低繁品種：遼寧絨山羊）之間的關(guān)系。計(jì)算產(chǎn)羔數(shù)和窩重的平均數(shù)后，基因型的效應(yīng)采用單因素方差分析。多重比較采用Tukey 法。

2 結(jié)果

2.1GJB2和GJB6基因多態(tài)性分析 基因分型結(jié)果表明（圖1），4 個(gè)候選位點(diǎn)均存在多態(tài)性。群體遺傳學(xué)分析（表2）表明，GJB2基因g.50675977G＞A 和g.50676288T＞C位點(diǎn)在云上黑山羊和濟(jì)寧青山羊群體中為中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），而在遼寧絨山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；GJB6基因g.50694816A＞G 位點(diǎn)在濟(jì)寧青山羊群體中為中度多態(tài)，而在云上黑山羊和遼寧絨山羊群體中為低度多態(tài)；GJB6基因g.50694819G＞A 在3個(gè)群體中均為低度多態(tài)。卡方檢驗(yàn)表明，除GJB2基因g.50676288T＞C 和GJB6基因g.50694816A＞G在遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（P＜0.05）外，其他位點(diǎn)在3 個(gè)群體中處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表2 候選位點(diǎn)在3 個(gè)山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

圖1 基因分型結(jié)果

2.2 候選位點(diǎn)與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析 如表3 所示，4個(gè)候選位點(diǎn)在不同繁殖力品種（濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊）中的基因型分布存在極顯著差異。云上黑山羊中的關(guān)聯(lián)（表4）分析表明，GJB2基因的2 個(gè)位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響；所有候選位點(diǎn)對(duì)初生窩重和斷奶窩重?zé)o顯著影響；GJB6基因g.50694816A＞G AA 型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG 型；GJB6基因g.50694819G＞A GG 型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AG 型。GJB6的組合基因型分析發(fā)現(xiàn)，AAGG 型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AGGG 型。

表3 候選位點(diǎn)基因型與不同繁殖力品種的卡方檢驗(yàn)

表4 GJB2 和GJB6 對(duì)云上黑山羊產(chǎn)羔性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討 論

對(duì)母畜來說，卵巢卵泡/卵母細(xì)胞的發(fā)育、輸卵管壺腹部的受精、子宮的著床及胚胎發(fā)育等生理過程均深刻影響繁殖結(jié)果。卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞的相對(duì)位置決定了間隙連接在卵泡發(fā)育中的重要作用。顆粒細(xì)胞通過間隙連接向卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、cAMP 和cGMP，以促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和減數(shù)分裂[18]。體外研究表明，牛卵巢顆粒細(xì)胞的間隙連接比膜細(xì)胞強(qiáng)；卵泡刺激素（FSH）促進(jìn)小卵泡顆粒細(xì)胞間的間隙連接；黃體生成素（LH）促進(jìn)大卵泡膜細(xì)胞的間隙連接[19]。因此，F(xiàn)SH 和LH 影響牛卵泡內(nèi)細(xì)胞間的間隙連接，從而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和維持。由于Cx 家族成員眾多，具體是哪些或哪幾個(gè)成員主要影響促性腺激素對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控尚不清楚。但也不排除GJB2 和GJB6 在該過程中起重要作用的可能。GJB2 和GJB6 可能影響著床和胚胎發(fā)育過程。大鼠中，雌激素和孕酮同時(shí)處理可提高GJB2在子宮上皮的表達(dá)，抑制其在腺上皮的表達(dá)[20]。體外實(shí)驗(yàn)表明，GJB2 和GJB6 在人卵丘細(xì)胞中的表達(dá)局限于細(xì)胞質(zhì)，對(duì)胚胎質(zhì)量的影響不及Cx43[21]。Cx 在山羊上的相關(guān)研究較少。綜上，GJB2和GJB6可能通過間隙連接影響動(dòng)物繁殖過程，尤其是卵泡發(fā)育過程。

查詢Ensembl 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在世界山羊群體中GJB6基因g.50694816A＞G位點(diǎn)A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因（等位基因頻率92%），而GJB6基因g.50694819G＞A 是一個(gè)新位點(diǎn)。在云上黑山羊群體中，GJB6基因g.50694816A＞G 和g.50694819G＞A 表現(xiàn)為低度多態(tài)，且優(yōu)勢(shì)基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)較高，所以單個(gè)基因型的選擇潛力可能不大，而組合基因型AAGG 的選擇效果可能比較理想。這2 個(gè)位點(diǎn)均是同義突變，對(duì)山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響機(jī)制尚不清楚，但這并不影響其作為分子標(biāo)記在山羊育種中的應(yīng)用。后續(xù)研究這2 個(gè)位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)量的影響可能有助于理解其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系。此外，本研究使用的濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊無具體產(chǎn)羔記錄，僅按品種特征分類，未考慮群體內(nèi)表型的變異和群體結(jié)構(gòu)的影響。因此，今后應(yīng)擴(kuò)大擁有詳細(xì)產(chǎn)羔記錄的群體進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

GJB2基因的2 個(gè)位點(diǎn)g.50675977G＞A 和g.50676 288T＞C 不適合作為云上黑山羊產(chǎn)羔性能的分子標(biāo)記。GJB6基因的2 個(gè)位點(diǎn)g.50694816A＞G 和g.50694819G＞A 可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記，但不適合窩重選擇。