徐 劍 葉 鵬 夏茂甜 趙文植 王正德 王 飛 李衛(wèi)英 辛培堯

（1. 西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南風景園林工程技術研究中心，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650233）

植物遺傳多樣性分析，可以挖掘物種優(yōu)良基因資源、掌握遺傳變異規(guī)律、揭示物種的進化過程及潛力等，是植物遺傳多樣性保護和利用的重要工具[1]。華山松（Pinus armandii）是松科（Pinaceae）松屬的常綠喬木樹種之一，也是我國特有的多用途樹木，分布范圍廣，經(jīng)濟價值高，可食用、材用，是重要的造林樹種[2]。種子園是由優(yōu)良遺傳特性的林木組成的人工林，是實現(xiàn)林木良種化的重要途徑之一[3]。目前，諸多研究人員已在貴州、云南等地營建了華山松無性系初級種子園，并進行了輔助授粉、病蟲害防治等相關工作[4-5]。然而，全國多個省區(qū)大面積營建華山松單一類型的人工純林，導致華山松的生長量持續(xù)衰退減少，病蟲害增加。因此，基于華山松的自然資源分布以及人工種植的狀況，對華山松進行遺傳多樣性研究，從而指導其遺傳改良工作顯得尤為重要。多年來，國內(nèi)相關研究者從最初的以表型為基礎，發(fā)展到現(xiàn)在從分子水平上開展華山松優(yōu)良基因資源的發(fā)掘，對其種質(zhì)資源高效合理的利用進行遺傳改良，以提高林分質(zhì)量[6]。祝娟[7]曾對華山松自然分布區(qū)內(nèi)52個種源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行了SSR研究，對其影響遺傳結(jié)構(gòu)和物種分化的因素進行了探討。朱曉丹[8]、劉成等[9]和趙楊等[10]分別將RAPD、SRAP和ISSR標記運用在華山松相關的遺傳多樣性分析中，為華山松的遺傳改良工作奠定了基礎。

研究物種的遺傳多樣性可以從其形態(tài)特征水平、染色體水平、生化生理水平以及分子水平來進行[11]。相比于傳統(tǒng)形態(tài)學而言，現(xiàn)代分子標記技術可以準確、快捷地反映出物種的遺傳物質(zhì)和表達產(chǎn)物的遺傳變異，且這種方式的運用與目標基因緊密相關，不易受到外界環(huán)境或其它基因效應的影響，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。目標起始密碼子多態(tài)性分子標記（SCoT）是一種基于單引物擴增反應的目的基因分子標記方法[12]，是以植物基因中起始密碼子ATG側(cè)翼序列的保守性和一致性設計單引物為原理，繼而對基因進行擴增，能有效地產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標記，也是一種能跟蹤性狀的新型分子標記[13]。SCoT分子標記憑借其具有穩(wěn)定性、多態(tài)性較高，特異性較強和重復性較好等優(yōu)點，目前已在多種農(nóng)作物的分子生物學研究中得到應用[14-18]。

本研究以云南省楚雄市紫溪山林場華山松種子園內(nèi)不同種源無性系為材料，利用SCoT標記技術分析不同種源華山松無性系的遺傳變異及其親緣關系，從而對園內(nèi)華山松種質(zhì)資源進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料采集于楚雄市紫溪山林場華山松種子園，共計97份，分別來自于會澤縣、巍山縣、騰沖市、楚雄市、南華縣和宜良縣等6個不同種源地（表1），選取無病蟲害的新鮮幼嫩針葉作為實驗材料，按單株編號裝入自封袋，做好標記，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

表1 華山松6個自然群體的地理位置信息及樣本數(shù)Table 1 Geographical information and number of samples of 6 natural populations of P. armandii

1.2 華山松DNA提取與檢測

摘取5～10根冷凍的華山松葉樣，采用2×CTAB法對無病害的幼嫩新鮮葉樣進行DNA的提取。將提取出的華山松DNA用1%的瓊脂糖電泳凝膠進行檢測，對于DNA的提取效果，瓊脂糖電泳凝膠以條帶明亮，無拖帶現(xiàn)象效果最佳。提取出來的華山松DNA濃度應在100 ng/μL以上150 ng/μL以下為最佳，最后將DNA放入-20 ℃冰箱中保存。

1.3 SCoT-PCR擴增

實驗所用引物選用蔡元保等[19]、陳熙等[20]已報道的相關文獻中公布的SCoT引物共40個。將符合實驗要求的華山松DNA進行SCoT-PCR擴增，反應體系如下：ddH2O 9.5 μL、Green Taq Mix 12.5 μL、Primer 1 μL、模板DNA 1 μL，總體積24 μL。SCoT-PCR擴增反應程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 s；50 ℃退火（可根據(jù)實 際情 況進 行 調(diào)整）1 min；72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)；再延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.4 SCoT引物篩選

選取來自6個不同種源（表1）的華山松葉樣，每個種源取1個樣本進行初篩和復篩，共篩選出34個反應穩(wěn)定、條帶清晰且具有較好多態(tài)性的SCoT引物（表2）。

表2 華山松34個SCoT引物信息Table 2 Thirty-four SCoT primer information in P. armandii

1.5 數(shù)據(jù)分析

將6個種源共計97份華山松樣品DNA與復篩得到的具有較好多態(tài)性的引物進行PCR擴增，再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測全部樣品的遺傳多樣性，首先統(tǒng)計確定每個引物在所有供試樣品中有多少互異條帶，匯總各位點信息，錄入到WPS表格中。

利用POPGEN1.32計算華山松群體等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因流（Nm）、和Shannon多樣指數(shù)等；依據(jù)POPGEN1.32計算出華山松群體Nei's遺傳距離數(shù)據(jù)，用NTSYS 2.10e構(gòu)建群體的聚類圖；用Structure 2.3.1使用MCMC方法評估多態(tài)位點的基因數(shù)據(jù)并建模聚類，估計最佳群體組群數(shù)K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松DNA提取

運用1%的瓊脂糖電泳凝膠技術檢測提取的6個種源共計97份華山松DNA，部分結(jié)果如圖1所示，可以看出，實驗樣本DNA條帶清晰明亮，無明顯拖帶彌散現(xiàn)象，基本符合總體實驗的要求。

圖1 部分華山松樣本DNA瓊脂糖電泳檢測結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis detection results of partial P. armandii

2.2 多態(tài)性引物篩選

本研究利用40個SCoT引物對6個不同種源（每個種源各1個）華山松樣品DNA進行引物篩選，其中34個引物可獲得明亮、無拖尾現(xiàn)象的清晰譜帶，均可用于后續(xù)復篩實驗。部分結(jié)果如圖2所示。

圖2 部分引物初篩結(jié)果Fig. 2 Partial image of primer screening results

2.3 遺傳多樣性分析

華山松各種源的多樣性信息見表3，由表3可知，6個種源的等位基因數(shù)，巍山（6.235 3）＞會澤（5.911 8）＞楚雄（5.794 1）＞騰沖（5.058 8）＞南華（4.323 5）＞宜良（4.264 7），平均值為5.264 7。種源有效等位基因數(shù)為3.104 8（南華）～3.892 6（巍山），平均值為3.490 4。種源Shannon's多樣性指數(shù)為1.230 9（南華）～1.519 7（巍山），數(shù)值大小為：巍山＞會澤＞楚雄＞騰沖＞宜良＞南華，且所有種源的多樣性指數(shù)均大于1。由表3還可以看出，6個種源的Nei's基因多樣性指數(shù)（H）的平均值為0.690 4，最高值為巍山（0.728 7），最低值為南華（0.646 7）?；诮y(tǒng)計分析可知，在這4個參數(shù)方面，巍山、楚雄和會澤3個種源均普遍高于騰沖、宜良和南華。結(jié)果表明，總體上來說，本研究中6個華山松種源有著較高的遺傳多樣性。

表3 華山松種源遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計表Table 3 The genetic diversity information of P. armandii provenances

2.4 聚類分析

通過計算華山松6個種源兩兩之間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，可以更進一步了解種子園內(nèi)華山松群體間的遺傳背景和親緣關系。遺傳距離可以體現(xiàn)種源間的遺傳分化程度和遺傳差異，在遺傳多樣性研究中是一項重要的參考指標。結(jié)果如表4所示，華山松6個種源的遺傳相似系數(shù)在0.795 5～0.933 1之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.851 6；遺傳距離范圍0.069 2～0.228 8，平均值為0.161 6，可以看出，兩兩種源間的平均遺傳距離趨近于0，且平均遺傳相似系數(shù)趨近于1，總體來說，6個種源間有較近的親緣關系。其中，巍山和會澤2個種源之間的遺傳相似系數(shù)最大，遺傳距離最小，這表明6個種源間，巍山和會澤的親緣關系最近，遺傳差異較小，相反，宜良種源和會澤種源的遺傳相似系數(shù)最小，遺傳距離最大，二者之間的親緣關系最遠，遺傳差異較大。

表4 華山松種源間Nei's遺傳相似系數(shù)（對角線上方）和遺傳距離（對角線下方）Table 4 Nei's genetic identity(above the diagonal) and genetic distance(below the diagonal) of P. armandii provenances

基于華山松6個種源間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，利用NTSYS2.10軟件對其進行聚類分析，構(gòu)建UPGMA聚類圖，其結(jié)果如圖3所示。以0.822為閾值，將6個種源歸為3類：會澤、巍山、楚雄、騰沖遺傳距離較近，歸為一類；宜良和南華各為一類。以0.868為閾值時可歸為4類：會澤、巍山、楚雄種源間的親緣關系較近，可聚為一類；騰沖、宜良、南華分別單歸為一類。利用GenAIEx進行Mantel檢測，結(jié)果如圖4所示，r=-0.131（r＜0），P=0.360（P＞0.05），表明6個華山松種源間的遺傳距離和地理不存在顯著相關性，地理距離并未對其遺傳距離造成明顯影響。

圖3 華山松6個種源聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of 6 provenances in P. armandii

圖4 Mantel檢測距離和遺傳地理距離的相關性Fig. 4 Correlation of Mantel detection distance and genetic geographic distance

2.5 遺傳分化分析

通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知，楚雄紫溪山林場華山松種子園內(nèi)6個種源的基因流Nm平均值為4.368 3＞1，且遺傳分化系數(shù)（Gst）值為0.054 1，結(jié)果說明種源間存在5.41%的遺傳變異，種源內(nèi)存在94.59%的遺傳變異，綜上所述，楚雄紫溪山林場華山松種子園的遺傳變異主要來源于種源內(nèi)。由此可推斷，高水平的基因流對各種源間產(chǎn)生均質(zhì)化作用，削弱了其遺傳差異，導致華山松種源間出現(xiàn)遺傳分化較低的現(xiàn)象。

采用Structure2.3.1軟件，基于數(shù)學模型分析由97個華山松無性系材料構(gòu)成的群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5和圖6所示。K值為橫坐標，設定在1～10之間，由圖5可知，隨著K值的增大，lnP（D）呈持續(xù)增大趨勢。根據(jù)Evanno等[21]報道的方法，經(jīng)過分析來確定最優(yōu)群體數(shù)K，可知，在K=2時，ΔK為最大值，表明將6個華山松種源劃分為2個類群與上述PCoA聚類分析結(jié)果一致，第1個類群包括會澤種源、巍山種源、楚雄、騰沖和宜良種源共5個種源；第2個類群包括1個南華種源。參考陳越等[22]的研究，在該Structure群體遺傳分析中，材料的遺傳組分（Q值）是一項重要指標。在圖6中，分析97個華山松無性系材料的最大Q值分布發(fā)現(xiàn)，其中Q≥0.6的共計53個無性系，占54.64%，說明這53個無性系擁有較為單一的遺傳結(jié)構(gòu)；而剩余的44個無性系的Q值＜0.6，占45.36%，此部分無性系的遺傳背景較為復雜，由此可知，6個華山松種源間存在基因滲透現(xiàn)象。

圖5 lnP（D）和ΔK隨K值的變化趨勢Fig. 5 Trend of lnP(D) and ΔK with K value

圖6 樣品材料群組遺傳結(jié)構(gòu)Fig. 6 Group genetic structure of sample material

3 結(jié)論與討論

華山松的遺傳多樣性研究是進行華山松育種工作的重要環(huán)節(jié)，借助種源間親緣關系的分析可以挖掘優(yōu)良基因，有效地對親本選配和后期林木遺傳育種保護提供指導。本研究結(jié)果顯示，華山松6個種源的基因多樣度為0.690 4，Shannon's多樣性指數(shù)為1.378 6，遺傳分化系數(shù)（Gst）值為0.054 1，表明種子園內(nèi)不同無性系擁有較高水平的遺傳多樣性，且遺傳分化主要存在于種源內(nèi)。此外，朱曉丹[8]和劉成等[9]分別采用RAPD和SRAP標記對楚雄紫溪山華山松種子園進行了遺傳多樣性分析，2項研究皆表明該種子園遺傳多樣性豐富，各種源內(nèi)的遺傳分化遠大于種源間，與本實驗相一致。相比于RAPD和SRAP標記，SCoT標記既擁有較好的重復性又保證了其穩(wěn)定性，因此對所提取的DNA質(zhì)量要求較低，同時可以檢測出更豐富的遺傳信息。蒙東萍[23]、韋泳麗等[24]曾在對羅漢松（Podocarpus macrophyllus）的遺傳多樣性研究中指出，SCoT分子標記可以反映豐富的遺傳信息，表現(xiàn)出較高的標記效率和多態(tài)性，對研究對象的數(shù)量以及遺傳背景無過多要求。于是，在后續(xù)的雜交育種研究中，應以DNA水平分析的結(jié)果為主要依據(jù)，如在巍山種源和楚雄種源內(nèi)的不同無性系間選配雜交組合，從而提高其雜交親合性和豐富雜種后代的基因型。

遺傳相似系數(shù)和遺傳距離是衡量群體間遺傳關系的重要指標。遺傳距離大、遺傳相似系數(shù)小表明群體間親緣關系遠，遺傳距離小、遺傳相似系數(shù)大表明群體間親緣關系近[25]。本研究中，巍山和會澤2個種源之間的遺傳相似系數(shù)最大，遺傳距離最小，可知二者遺傳差異小，遺傳相似程度高，相反，宜良和會澤種源的遺傳相似系數(shù)最小，遺傳距離最大，說明其存在一定程度的遺傳差異。一般認為，自然地理分布較近的種源之間存在相似的遺傳基礎，遺傳差異較小，反之，地理位置較遠的種源間遺傳差異較大。根據(jù)6個華山松種源的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)通過NTSYS軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，騰沖種源和巍山種源地理距離和遺傳距離均較為接近，被歸為一類，符合這一說法。然而，地理距離較近的南華種源和巍山種源，或會澤種源和宜良種源之間卻沒有被歸為一類，顯然該聚類結(jié)果不符合物種地域性分布。李彬[26]在對珊瑚菜（Glehnia littoralis）的研究中曾發(fā)現(xiàn)，兩兩居群間地理距離相近的遺傳相似程度并不高，沒有被歸為一類，相反，地理距離相距較遠的居群在NTSYS聚類檢測中被聚在一起。此外，在對唐古特大黃（Rheum tanguticum）和裸果木（Gymnocarpos przewalskii）的研究中均發(fā)現(xiàn)，地理距離與種群間遺傳距離沒有直接的相關關系[27-28]。這可能是因為植物群體的遺傳結(jié)構(gòu)不僅受其自然地理分布距離的影響，還包括生態(tài)氣候因子或人為活動干擾等諸多因素有關。

基因流（Nm）是決定物種遺傳變異和導致物種進化的重要因素之一。本研究中華山松群體的Nm為4.368 3，Nm＞1，通過遺傳結(jié)構(gòu)分析可知，華山松種源內(nèi)的遺傳變異顯著大于種源間的遺傳變異，6個華山松種源間存在基因滲透現(xiàn)象。華山松果實味道鮮香，深得部分鳥類、獸類的喜愛，從而可能會得到長距離的傳播，促進了種子流，而降低了種源間的遺傳分化[29]。同時，造林單位間的種源的調(diào)動，也可能是原因之一。此外，種子或花粉的傳播在傳遞和交換遺傳變異的同時會受到諸多新的或變化的生態(tài)因子的影響，比如氣候、土壤和地理結(jié)構(gòu)等，從而為這些不同的遺傳來源提供新的選擇和適應，最終可能導致遺傳變異[7]。