楊慧芹 余萬都 張麗穎 高冬麗 尚 軼 馬 玲

（云南師范大學(xué)云南省馬鈴薯生物學(xué)重點實驗室，馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosum），為茄科茄屬1年生草本植物，又稱土豆、地蛋、洋芋等[1]。馬鈴薯種植可追溯到公元前8 000～5 000年的秘魯南部。其形態(tài)特征為草本，莖分地上莖和地下莖兩部分，可食用部分為地下莖。地下莖呈塊狀，扁球形或長圓形，直徑3～10 cm，外皮呈白色、淺紅色或紫色。馬鈴薯是全球第四大糧食作物，僅次于玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）和小麥（Triticum aestivum），已成為世界性重要的口糧來源和多種工業(yè)加工原料[2]。馬鈴薯在云南省的種植更為普遍，現(xiàn)已成為云南省第三大農(nóng)作物，并成為促進(jìn)云南貧困地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要產(chǎn)業(yè)。馬鈴薯因其含較多的淀粉、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等，深受廣大人民群眾的喜愛[3]。除了食用價值之外，馬鈴薯還具有調(diào)中、健脾益氣、消炎解毒等廣泛的藥用價值，所含酚酸、黃酮等酚類物質(zhì)具有多種保健作用[4]。

酚類化合物是植物中分布最廣泛的次生代謝產(chǎn)物，在植物生長發(fā)育和逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。馬鈴薯中最主要的酚類物質(zhì)是綠原酸（CGA），它是一種天然的抗氧化劑，其抗氧化能力要強(qiáng)于咖啡酸、對羥苯酸、阿魏酸、丁香酸、J基羥基茵香醚和生育酚[5]，在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化劑。綠原酸，化學(xué)名稱為3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式為C6H18O9。綠原酸具有廣泛的生物活性，研究表明綠原酸對急性咽喉炎癥和化膿性皮膚疾病療效顯著，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種藥用功能，現(xiàn)代科學(xué)對綠原酸生物活性的研究已深入到食品、醫(yī)藥、保健和日用化工等領(lǐng)域[6]。此外，綠原酸等酚類物質(zhì)在植物抗病中也具有重要作用[7]。在體外實驗中，綠原酸具有廣泛的抗真菌活性，能完全抑制孢子萌發(fā)或菌絲長度從而起到殺菌劑的作用。有研究表明，綠原酸能有效抑制馬鈴薯瘡痂病、黑脛病和晚疫病等病原菌的侵染[8]。通過HQT合成綠原酸的途徑是其主要的合成途徑[9-10]，目前對這一途徑中HQT基因功能的研究較為深入，越來越多的實驗證明了它與綠原酸合成的直接關(guān)系。大量研究結(jié)果表明，在富含綠原酸的植物，如番茄（Lycopersicon esculentum）、煙草（Nicotiana tabacum）、朝鮮薊（Cynara scolymus）、咖啡（Coffea arabica）和金銀花（Lonicera japonica）中都存在HQT基因，并且HQT在體內(nèi)體外都可以直接催化咖啡酰輔酶A與奎寧酸生成綠原酸[6]。研究表明，過表達(dá)HQT基因能明顯提高植物體內(nèi)的綠原酸含量[11-12]；相反，沉默HQT基因后綠原酸含量顯著下降[13]。

水楊酸（SA）作為一種信號分子，在植物的抗病過程中發(fā)揮著重要作用，它能誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得性抗性，激活植物抗性反應(yīng)，誘導(dǎo)某些抗性基因及抗性相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)植物對細(xì)菌、真菌和病毒等產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[14]。鑒于綠原酸在植物抗病性方面具有重要作用，本研究以水楊酸作為誘導(dǎo)劑，對二倍體馬鈴薯葉片進(jìn)行葉面噴施，研究了水楊酸對馬鈴薯綠原酸含量及關(guān)鍵酶基因HQT表達(dá)的影響，為綠原酸在植物抗病方面的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的材料為國際馬鈴薯中心（CIP）提供的二倍體馬鈴薯CIP-65。取苗齡為3周的CIP-65無菌苗，選擇狀態(tài)良好，長勢一致的移栽到直徑25 cm的花盆中，置于溫室內(nèi)正常生長。

1.2 試驗方法

1.2.1 SA葉面噴施處理

馬鈴薯苗移栽30 d后，分別用0.01、0.1、1 mmol/L的SA進(jìn)行葉面噴施，在處理后不同時間段（6、12、24 h）分別進(jìn)行葉片樣品采集（選取植株頂端完全展開、狀態(tài)良好、無任何病變的功能葉），液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ? h未經(jīng)任何處理的葉片樣品作為對照。

1.2.2 綠原酸含量測定

參照鐘方曉[15]的方法稍作修改：準(zhǔn)確稱取0.2 g馬鈴薯葉片樣品，加入2 mL 75%乙醇研磨勻漿，超聲波在4 ℃條件下震蕩萃取30 min，萃取結(jié)束后，4 ℃，12 000 r/min離心2 min，取上清適當(dāng)稀釋后于327 nm波長下檢測吸光度，以75%乙醇為空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以75%乙醇為溶劑，先配制成100 mL含綠原酸20 mg的溶液，再依次配制成100 mL中含綠原酸0.5、1.0、1.5、2.0 mg 4種不同濃度的綠原酸準(zhǔn)溶液。取2 mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于327 nm處測出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，以2 mL 75%乙醇代替綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白。以系列標(biāo)準(zhǔn)綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)。

1.2.3RNA提取和qRT-PCR

用天根公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒來提取馬鈴薯葉片樣品中的總RNA。提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計進(jìn)行檢測，A260/A280值在1.8～2.1之間。按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)TaKaRa公司的熒光定量分析試劑盒TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）來進(jìn)行。采用StepOnePlus實時熒光定量PCR儀對馬鈴薯CGA合成關(guān)鍵酶基因StHQT進(jìn)行表達(dá)檢測，以馬鈴薯的Actin基因作為內(nèi)參基因[16]，用Vector NTI軟件來設(shè)計引物，序列如表1。采用2-ΔΔCT法對目的基因進(jìn)行相對定量差異表達(dá)分析。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 11.5軟件，采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行繪圖，圖表中的小寫字母表示鄧肯氏新復(fù)極差測驗在P=0.05水平上呈顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對馬鈴薯葉片綠原酸含量的影響

經(jīng)葉面噴施水楊酸處理后，馬鈴薯葉片內(nèi)綠原酸含量變化如圖1所示。從圖中可以看出，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA處理都能明顯提高馬鈴薯葉片內(nèi)的綠原酸含量，而1 mmol/L SA處理的效果不太明顯。處理后6 h時，0.01 mmol/L SA處理的馬鈴薯葉片中綠原酸含量劇增，顯著高于其他組中綠原酸含量的水平（P＜0.05）；0.1 mmol/L SA處理的綠原酸含量也明顯增加（P＜0.05），但低于0.01 mmol/L SA處理的；而1 mmol/L SA處理的綠原酸含量有所下降。處理后12 h時，0.01 mmol/L SA處理的綠原酸含量繼續(xù)增加至最高，顯著高于其他2組處理的水平（P＜0.05）；0.1 mmol/L SA處理的綠原酸含量恢復(fù)到初始水平；1 mmol/L SA處理的綠原酸含量有所提高，但差異不顯著。處理后24 h時，0.01 mmol/L SA處理的綠原酸含量恢復(fù)到初始水平，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA處理的綠原酸含量也有輕微下降；此時0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA處理的綠原酸含量差異不明顯，1 mmol/L SA處理綠原酸含量顯著低于0.1 mmol/L SA處理的（P＜0.05），但與0.01 mmol/L SA處理的差異不顯著。

圖1 葉面噴施水楊酸對馬鈴薯葉片綠原酸含量的影響Fig. 1 Effect of foliar application of SA on the content of CGA in S. tuberosum leaves

2.2 水楊酸對馬鈴薯葉片HQT基因表達(dá)的影響

經(jīng)葉面噴施水楊酸處理后，馬鈴薯葉片內(nèi)綠原酸合成關(guān)鍵酶基因HQT的表達(dá)變化見圖2。處理后6 h時，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA處理的HQT基因表達(dá)量均有一定程度的增高，但差異不顯著；1 mmol/L SA處理的HQT基因表達(dá)量無明顯變化。處理后12 h時，3個濃度SA處理的HQT基因表達(dá)量都明顯增高，且0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA處理的HQT基因表達(dá)量顯著高于1 mmol/L SA處理的（P＜0.05）。到處理后24 h時，3個濃度SA處理的HQT基因表達(dá)量都明顯降低，但0.01 mmol/L SA處理的HQT基因表達(dá)水平仍顯著高于其他2個濃度處理的（P＜0.05）。

圖2 葉面噴施水楊酸對馬鈴薯葉片HQT基因表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of foliar application of SA on gene expression of HQT in S. tuberosum leaves

3 結(jié)論與討論

SA是植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源信號分子之一，在植物的生長、發(fā)育、成熟、衰老等生理過程以及抗鹽、抗旱、抗低溫、抗紫外線、抗重金屬等抗逆反應(yīng)的誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。SA能夠有效促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長，誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，提高植株體內(nèi)保護(hù)酶活性，提高抗逆性，以緩解逆境脅迫下對植物造成的危害。此外，SA還能誘導(dǎo)植物對病毒、真菌及細(xì)菌等病原生物產(chǎn)生廣譜而持久的抗性[17]。

葉面噴施是促進(jìn)植物生長和次生代謝物積累的有效手段。在外源性水楊酸應(yīng)用中，不同濃度對作物的影響效果不同，高濃度水楊酸會抑制植物的生長，只有在適宜的濃度下水楊酸才會對植物產(chǎn)生有利的影響。研究表明，15 mg/L的SA處理對菊花（Dendranthema morifolium）中總糖、總蛋白、總氨基酸、VC含量以及SOD活性都有不同程度的提高[18]。2 mmol / L的SA噴施丹參幼苗后，能有效調(diào)控蔗糖合成酶的活性，降低根中蔗糖合成酶的降解活性，從而增加蔗糖在丹參（Salvia miltiorrhiza）幼苗中的積累，并產(chǎn)生一定的影響[19]。0.1 mmol/L的外源SA能有效促進(jìn)低溫脅迫下黃瓜（Cucumis sativus）植株光合速率的增加，維持植株體內(nèi)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而使黃瓜植株在低溫脅迫下良好的生長[20]。苗志奇等[21]的研究表明，0.1 mg/L的SA可以提高紅豆杉（Taxus wallichianavar.chinensis）細(xì)胞培養(yǎng)體系中紫杉醇生物合成途徑的代謝通量，使紫杉醇含量是對照組的4倍；當(dāng)SA的濃度超過0.1 mg/L，紫杉醇和其他紫衫烷類物質(zhì)都出現(xiàn)下降。李鉑等[22]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施0.5 mmol/L的SA能夠促進(jìn)當(dāng)歸（Angelica sinensis）幼苗生長，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗保護(hù)酶的活性，超過此濃度，植株生長受到抑制。王宏虬等[23]研究發(fā)現(xiàn)，SA在濃度為1.00 mmol/L時能顯著提高馬鈴薯葉片中色素、可溶性蛋白及相關(guān)酶系（POD、CAT、PPO、PAL）含量，降低葉片中SAFR和MDA含量，增強(qiáng)馬鈴薯對瘡痂病的抗性。本研究中，不同濃度SA處理對馬鈴薯葉片中綠原酸含量及HQT基因表達(dá)的影響不同：低濃度水楊酸（0.01 mmol/L）處理后，馬鈴薯葉片中的CGA含量明顯提高，HQT基因的表達(dá)也被激活，與綠原酸變化趨勢一致，表明HQT基因與綠原酸的生物合成有直接關(guān)系；中等濃度（0.1 mmol/L）的SA處理也明顯提高了馬鈴薯葉片中HQT的表達(dá)量和CGA含量，但CGA含量的增幅低于0.01 mmol/L的SA處理；高濃度（0.1 mmol/L）的SA處理也在一定程度上促進(jìn)了HQT基因的表達(dá)，但綠原酸的含量與處理前相比差異不大，表明只有適宜濃度的SA才能夠促進(jìn)馬鈴薯葉片綠原酸的合成與積累。本研究中馬鈴薯葉片的最佳處理濃度為0.01 mmol/L，與其他研究所使用的濃度存在一定差異，這可能是由于不同植物對SA的響應(yīng)具有一定的差異造成的。

綠原酸等酚類物質(zhì)是普遍存在于植物體內(nèi)的一類次生代謝產(chǎn)物，具有許多關(guān)鍵的生理功能，對植物的品質(zhì)和產(chǎn)量起著重要的作用。隨著科學(xué)研究的深入，酚類物質(zhì)與植物抗病性之間的關(guān)系得到進(jìn)一步證實，這個領(lǐng)域的研究近年來愈發(fā)引人注目。本研究以二倍體馬鈴薯為試驗材料，采用葉面噴施的方式，探究馬鈴薯綠原酸及其合成關(guān)鍵酶基因HQT對抗病激素SA的響應(yīng)情況，可為綠原酸在植物抗病方面的研究提供一定的參考。