董閃閃，范劉敏，李云菲，相啟森*

鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450001）

酶促褐變是果蔬加工和貯藏過程中遇到的主要問題之一，對色澤、口感、風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值造成不良影響，并嚴(yán)重影響消費(fèi)者對產(chǎn)品的接受程度，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。多酚氧化酶（Polyphenol oxidases，PPOs）是引起果蔬加工過程中發(fā)生褐變的主要酶類。目前，主要采用物理方法和化學(xué)方法抑制酶促褐變。物理方法通常是采用熱加工技術(shù)使多酚氧化酶等相關(guān)酶變性失活，從而有效抑制酶促褐變，但極易破壞果蔬中熱敏性物質(zhì)并造成營養(yǎng)和感官品質(zhì)的下降。此外過度熱處理也會(huì)通過加速酚類底物的自動(dòng)氧化反應(yīng)，從而引起非酶褐變[1,3]。化學(xué)方法通常是加入一些抗褐變劑，如二氧化硫、亞硫酸鹽、曲酸、檸檬酸等。但上述化學(xué)抑制劑過量使用，會(huì)對人體健康造成一定危害[4]。如何在有效保持營養(yǎng)和感官品質(zhì)的前提下控制酶促褐變反應(yīng)，是果蔬加工過程中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

隨著消費(fèi)者對食品安全、營養(yǎng)及感官品質(zhì)要求的提高，非熱加工技術(shù)在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[5]。研究證實(shí)，超高壓、超聲波、冷等離子體、微波、高壓二氧化碳等食品非熱加工技術(shù)都具有失活多酚氧化酶的作用，能夠達(dá)到果蔬保鮮的目的。綜述了近年來新型非熱加工技術(shù)失活多酚氧化酶的研究進(jìn)展，并對上述技術(shù)存在問題及今后研究方向進(jìn)行探討和展望，以期為果蔬酶促褐變控制研究提供理論參考。

1 多酚氧化酶性質(zhì)

參與果蔬酶促褐變的酶主要包括多酚氧化酶（PPOs）、過氧化物酶（Peroxidases，PODs）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyases，PALs），其中PPOs被認(rèn)為是導(dǎo)致酶促褐變反應(yīng)的主要酶類[6-7]。PPOs是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的一類含銅離子的蛋白酶。依據(jù)底物和作用機(jī)制的不同，PPOs可分為三類：第一類是甲酚酶（Cresolases，E.C.1.14.18.1），即存在于動(dòng)物中的酪氨酸酶（Tyrosinases），能催化單酚氧化成鄰酚（單酚氧化酶活性）和鄰酚氧化成鄰醌（兒茶酚氧化酶活性）；第二類是兒茶酚氧化酶（Catechol oxidases，E.C.1.10.3.1），能催化鄰酚氧化成鄰醌；第三類是漆酶（Laccases，E.C.1.10.3.2），能催化鄰位酚和對位酚氧化成對應(yīng)的醌類物質(zhì)[8-9]。上述反應(yīng)生成的半醌類和醌類物質(zhì)能夠與氨基酸、蛋白質(zhì)和多酚等發(fā)生親核反應(yīng)并形成褐色聚合物，從而導(dǎo)致褐變的發(fā)生（圖1）。

圖1 多酚氧化酶參與的酶促褐變反應(yīng)

2 非熱加工技術(shù)失活多酚氧化酶的研究進(jìn)展

2.1 超高壓技術(shù)

超高壓技術(shù)是指將100~1 000 MPa的靜態(tài)液體壓力施加于液態(tài)或固態(tài)食品、生物制品等物料并保持一定時(shí)間，從而達(dá)到殺菌、鈍酶及改善物料結(jié)構(gòu)和特性的目的，對食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生較小影響[10-11]。大量研究證實(shí)，超高壓處理對果蔬中PPOs有顯著的失活作用（表1）。

如表1所示，超高壓處理對果蔬產(chǎn)品中PPOs具有較好的失活效果。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理76 s時(shí)，木瓜中PPOs活性下降66%。同時(shí)，Keenan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理不但能顯著降低混合果漿中PPOs活性，而且對果漿中的總花青素、酚類物質(zhì)和色澤均無顯著影響。此外，超高壓處理與溫?zé)釁f(xié)同能夠更有效地失活PPOs。Sulaiman A等[15]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超高壓室溫下處理15 min后，草莓果漿中PPOs活性降低81%，而在62 ℃下處理相同時(shí)間時(shí)草莓果漿中PPOs活性降低98%，失活效果更為顯著。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理對PPOs存在激活現(xiàn)象。Terefe等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在400~600 MPa，60 ℃以上處理時(shí)藍(lán)莓PPOs活性顯著降低，而在60 ℃以下進(jìn)行超高壓處理時(shí)藍(lán)莓PPOs則會(huì)被激活；Engmann等[12]也得出類似研究結(jié)果。因此，應(yīng)根據(jù)待處理樣品不同性質(zhì)，優(yōu)化超高壓處理工藝參數(shù)，避免激活現(xiàn)象發(fā)生。綜上所述，超高壓處理對果蔬中的PPOs有顯著的失活效果，并且能夠很好地保持果蔬原有品質(zhì)；但與其他加工技術(shù)協(xié)同處理失活效果會(huì)更好。

表1 超高壓技術(shù)在失活果蔬中多酚氧化酶的應(yīng)用研究

2.2 冷等離子體技術(shù)

冷等離子技術(shù)是近幾年興起的食品加工新技術(shù)，具有處理時(shí)間短、溫度低、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在食品加工等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[17]。國內(nèi)外研究表明，冷等離子體處理能夠有效失活PPOs并抑制果蔬褐變，達(dá)到保鮮和延長貨架期的目的（表2）。

如表2所示，冷等離子體處理能夠顯著降低果蔬中PPOs的活性，失活效果隨處理時(shí)間延長和處理電壓的升高而增強(qiáng)。Illera等[19]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輝光放電冷等離子處理5 min后，鮮榨蘋果汁中PPOs活性降低84%，同時(shí)可以有效保持鮮榨蘋果汁的原有品質(zhì)并延長貯藏時(shí)間。Surowsky等[20]發(fā)現(xiàn)，介質(zhì)阻擋放電等離子體處理能夠有效失活椰汁中的PPOs。此外，在鮮切馬鈴薯[21]和鮮切蘋果[18,22]中也發(fā)現(xiàn)類似試驗(yàn)結(jié)果。Hou等[23]研究發(fā)現(xiàn)，冷等離子體處理顯著提高了鮮榨藍(lán)莓汁中多酚類物質(zhì)含量并能較好地保持藍(lán)莓汁的原有色澤。綜上所述，冷等離子體處理不僅能夠有效失活PPOs活性，并且能夠改善果蔬的品質(zhì)。

表2 冷等離子體在失活果蔬多酚氧化酶領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3 超聲波技術(shù)

超聲波是一種頻率介于2×104~1×109Hz之間的機(jī)械波，通過振動(dòng)可以改變物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及功能[24]。超聲波被廣泛用于食品加工業(yè)，主要用于食品加工中各個(gè)操作單元，如殺菌、鈍酶、果汁脫氣、風(fēng)味成分萃取等[25]。Sulaiman等[26]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理對梨、蘋果和草莓果漿中PPOs具有顯著的失活作用，失活規(guī)律遵循一級動(dòng)力學(xué)模型。Cao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，隨著超聲強(qiáng)度和處理時(shí)間增加，楊梅汁中PPOs的失活率顯著升高，在處理強(qiáng)度為90和181 W/cm2時(shí)，處理10 min后，PPOs活性分別降低至53.23%和12.84%；在處理強(qiáng)度為271和362 W/cm2時(shí)，處理8 min后，PPOs活性僅殘留4.22%和0.08%。此外，超聲波與其他技術(shù)聯(lián)合使用可以顯著增強(qiáng)鈍酶效果。Zhou等[28]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度（10，20和30 mmol/L）蘋果酸和超聲（25 kHz，55.48 W/cm2）單獨(dú)處理均不能顯著失活來源于雙孢蘑菇中的PPOs；超聲聯(lián)合不同濃度的蘋果酸（10~30 mmol/L）處理30 min后，PPOs活性分別降低32.3%，55.8%和69.8%；處理60 min后，PPOs的相對活性分別降低53.9%，86.2%和92.4%。另外，Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波預(yù)處理黃花菜可使其PPOs活性顯著降低；與熱預(yù)處理相比，超聲波預(yù)處理可以改善黃花菜色澤，并且有利于降低營養(yǎng)成分的損失。綜上所述，超聲波技術(shù)能夠有效失活果蔬中的PPOs并能夠較好保持果蔬原有品質(zhì)，與其他技術(shù)聯(lián)合使用能達(dá)到更好的鈍酶效果。

2.4 紫外輻射技術(shù)

紫外線（UV）是一種波長位于可見光和X射線之間的電磁波，按其波長不同可以分為長波紫外線（UVA，320~400 nm）、中波紫外線（UVB，280~320 nm）和短波紫外線（UVC，200~280 nm）[30]。其中，UV-C在食品中的應(yīng)用較為廣泛，已成功用于空氣、食品表面和飲用水等的消毒殺菌[31]。近年來，紫外線照射用于失活果蔬中的多酚氧化酶成為研究熱點(diǎn)。Aguilar等[32]研究發(fā)現(xiàn)，用紫外-可見光照射不同品種的桃汁，在45 ℃下照射60 min，3種桃汁中的PPOs均幾乎完全失活。同樣地，Augusto等[33]研究發(fā)現(xiàn)，UV處理15 min后椰汁中PPOs活性降低了92%，UV處理30 min后椰汁中PPOs活性則降低了98%。Akgun等[34]研究表明，紫外發(fā)光二極管處理能夠有效降低蘋果汁中PPOs的活性，在280~365 nm和280~405 nm發(fā)射波長下，處理40 min后，PPOs失活率分別為67.42%和65.62%。此外，Muller等[35]研究發(fā)現(xiàn)，鮮榨蘋果汁和葡萄汁中的PPOs活性隨UV-C處理強(qiáng)度的增加而顯著降低，經(jīng)UV-C（100.48 kJ/L）照射后，鮮榨蘋果汁和葡萄汁中的PPOs活性分別降低84.2%和39.1%，且蘋果汁和葡萄汁的理化性質(zhì)無顯著變化。綜上所述，紫外線照射具有較好的失活果蔬中多酚氧化酶的效果，是熱處理良好的替代方法。

2.5 高壓二氧化碳技術(shù)

高壓二氧化碳技術(shù)是壓力與二氧化碳相結(jié)合的技術(shù)，也稱為致密相二氧化碳或超臨界二氧化碳技術(shù)。高壓二氧化碳能夠有效地失活微生物和酶，并較好地保持食品的營養(yǎng)、感官和質(zhì)構(gòu)特性[29]。Benito-román等[36]研究表明，高壓二氧化碳處理能夠有效失活鮮榨梨汁中PPOs。經(jīng)高壓二氧化碳處理后的梨汁中PPOs殘存活性為19%，其鈍酶效果顯著高于相同溫度的熱處理，且在4 ℃條件下貯藏56 d后，PPOs的活性仍能得到較好的抑制。Manzocco等[37]研究發(fā)現(xiàn)，鮮榨蘋果汁中PPOs的失活率隨著二氧化碳壓力和溫度升高而增加。在最強(qiáng)處理?xiàng)l件下（18 MPa、45 ℃），鮮榨蘋果汁中PPOs活性降低80%，并且在4 ℃條件下儲(chǔ)藏后，感官品質(zhì)無顯著變化。此外，廖紅梅等[38]研究發(fā)現(xiàn)，高壓二氧化碳處理能夠有效抑制鮮榨梨汁在貯藏期間的酶促褐變，并能保持其色澤和貯藏品質(zhì)的穩(wěn)定性。綜上所述，高壓二氧化碳技術(shù)不僅能夠失活果蔬中PPOs，還能有效地保持果蔬的原有品質(zhì)，在果蔬食品加工貯藏保鮮領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

3 多酚氧化酶失活機(jī)理研究

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致多酚氧化酶活性喪失的主要原因是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其是蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)的變化[39]。Zhou等[28]通過圓二色光譜法分析發(fā)現(xiàn)，超聲聯(lián)合蘋果酸處理來源于雙孢蘑菇中的PPOs后，其負(fù)橢圓度增加，表明有序結(jié)構(gòu)減少，二級結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中α-螺旋含量降低，同時(shí)β-折疊的含量增加，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量沒有發(fā)生明顯變化；通過熒光光譜分析，進(jìn)一步觀察到PPOs的最大峰值波長發(fā)生紅移，表明其三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。同樣地，Surowsky等[20]研究發(fā)現(xiàn)冷等離子體可以在短時(shí)間（76 s）內(nèi)失活來源于雙孢蘑菇中的PPOs，圓二色光譜結(jié)果表明，未處理組PPOs結(jié)構(gòu)中α-螺旋和b-折疊含量分別為36.9%和17.8%，經(jīng)冷等離子體處理后，PPOs結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量降至17.8%，而β-折疊含量升高到29.4%；熒光光譜分析結(jié)果表明，最大吸收波長發(fā)生明顯紅移。以上結(jié)果表明，冷等離子體可能是通過破壞PPOs二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)而造成其失活。此外，Murtaza等[40]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高壓二氧化碳（55 ℃，25 MPa）處理的來源于雙孢蘑菇中的PPOs，其α-螺旋含量顯著降低，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加，說明其二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，通過熒光光譜分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，酶的三級結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而導(dǎo)致酶失活。綜上所述，非熱食品加工技術(shù)失活PPOs的機(jī)理主要是通過破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致酶失活。

4 討論與展望

熱處理是食品加工過程中鈍酶的主要方法，雖然具有良好效果，但對食品中的熱敏成分和營養(yǎng)物質(zhì)造成不良影響。近年來，超高壓、冷等離子體、超聲波、高壓二氧化碳等非熱技術(shù)在食品鈍酶領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。非熱加工技術(shù)普遍存在裝備處理量小、自動(dòng)化程度低等問題，多局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，還未大規(guī)模地用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，裝備的研發(fā)將是今后重要的研究方向之一。此外，非熱加工技術(shù)處理對食品安全性的影響也有待進(jìn)一步研究。