李朋超，孟陸麗，程謙偉*，胡波，楊菊，張萌

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

香蕉果實不僅營養(yǎng)成分豐富，而且所含的酚類化合物在降低患心血管疾病和癌癥風(fēng)險上有明顯的作用，因此在國際市場上有很高的需求[1-5]。香蕉作為一種呼吸躍變型的熱帶水果，在常溫下貯藏6~8 d后果肉快速軟化，果皮變黃，使其具有較短的保質(zhì)期[6-7]。低溫存儲已成為延緩果蔬成熟和延長果蔬貯藏期的最有效技術(shù)之一[8]。然而，香蕉果實和其他熱帶果實一樣，對低溫很敏感易發(fā)生冷害[9]。香蕉果實的冷害癥狀包括果皮快速褐變、發(fā)黑、點蝕和成熟異常，這大大降低了商品質(zhì)量和消費者的接受度[10]。

能量是生命活動的基礎(chǔ)，生物的所有生理活動都需要能量。越來越多的研究表明，水果的某些生理失調(diào)，包括褐變和冷害，可能與細(xì)胞能量水平的降低有關(guān)[11-12]。長期冷藏可能導(dǎo)致采后果實的ATP和能荷（EC）降低，從而導(dǎo)致能量代謝紊亂[13]。近年來有研究者對枇杷果、竹筍、黃瓜、桃、梨、芒果冷害與能量狀態(tài)的關(guān)系進(jìn)行了研究[14-20]。

目前，尚未有研究報道香蕉果實在不同溫度儲存中冷害發(fā)生程度與能量水平之間的變化。因此，試驗分別對在25，13和5 ℃儲存條件下香蕉果實的冷害指數(shù)、相對電導(dǎo)率、丙二醛、呼吸速率、表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和能量水平進(jìn)行了研究，揭示香蕉果實冷害發(fā)生的機(jī)理，旨在為香蕉果實采后冷藏保鮮技術(shù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水果材料和試驗設(shè)計

香蕉購買產(chǎn)于廣西南寧的高樂品種，采收期在5~6月。為減小誤差，選擇樣品在成熟度（未成熟）、顏色（淺綠色）、形狀和大小方面相似，并且沒有瑕疵和外部缺陷的香蕉果實隨機(jī)分為3組（每組30支），分別儲存在25，13和5 ℃和相對濕度為85%的條件下，用于相關(guān)生理指標(biāo)的測定。另外單獨取45支香蕉，隨機(jī)分為3組，每組15支（即每個溫度15支香蕉），用于呼吸速率的測定。在貯藏期間每隔3 d采集一次樣本。此外，由于冷害過程會產(chǎn)生褐變，為更準(zhǔn)確對香蕉冷害分級，使用1.2圖像處理裝置。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；圖像處理系統(tǒng)（自制）；FA-2104N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；H3-18KR高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；日立S-3400N掃描電鏡（日立日本技術(shù)公司）；DDS-11A相對電導(dǎo)率儀（上海虹益儀器儀表有限公司）；TU-1950型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 香蕉圖像采集系統(tǒng)

將香蕉樣品放在裝置托盤，數(shù)碼相機(jī)安裝在托盤上方約30 cm處，使用分辨率為600×400像素的數(shù)碼相機(jī)（MER-503-36U3C，大恒水星，中國，北京）進(jìn)行成像，圖像以BMP格式保存。使用Matlab R2014a（Mathworks，美國）進(jìn)行圖像處理。采集裝置如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

1.4 香蕉的圖像處理

香蕉表皮上的黑斑多呈黑色或深褐色，色彩偏暗片深；而正常香蕉通常呈黃色或綠色，顏色不深，并且香蕉拍攝箱體為鋁合金板，在箱內(nèi)光源照射下，背景偏白且亮度較高。因此，可以采用亮度特征將香蕉黑斑從圖像中分割出來。香蕉圖像中每一個像素點用R、G、B三個值表示其顏色，通過式（1），將每個像素點的顏色轉(zhuǎn)化為一定的灰度值Y，從而將彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像。

此外，通過巴特沃思濾波器對圖像進(jìn)行預(yù)處理，消除例如圖像直方圖均衡化和圖像傳輸引起的噪聲的預(yù)處理操作。然后，通過執(zhí)行Otsu自適應(yīng)閾值方法提取閾值，對香蕉圖像進(jìn)行圖像分割[21]。分割后的二值化圖像，黑色的像素點的區(qū)域?qū)?yīng)于香蕉的褐變區(qū)域，白色區(qū)域表示背景。

參考已有的圖像特征提取方法，采用分割后二值區(qū)域像素點的個數(shù)表示香蕉圖像的褐變面積。

1.5 冷害指數(shù)的測定

參考Yang等[22]的方法，并稍作修改。冷害程度分為5個等級，由褐變指數(shù)等級代替。褐變指數(shù)等級：0=無褐變；1=褐變面積＜25%；2=褐變面積25%~50%；3=褐變面積50%~75%；4=褐變面積大雨75%。冷害指數(shù)按式（2）計算。此處采用的褐變面積為圖像采集到的由冷害引起的褐變面積。

1.6 呼吸速率的測定和掃描電鏡

呼吸速率根據(jù)Chen等[23]的方法并稍作修改。呼吸速率的單位為mg CO2·kg-1·h-1。

參考Guo等[24]的方法，并稍作修改。用水沖洗除去果表的灰塵等異物。用雙刃刀片切取長、寬約為3 mm×2 mm的果皮數(shù)塊，投入0.1 mol/L PBS配制的2.5%pH 6.8的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h，固定好后的樣品用0.01 mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次。采用梯度叔丁醇分5級脫水，用體積分?jǐn)?shù)為100%的叔丁醇浸沒30 min，置于真空冷凍干燥機(jī)48 h，之后用電導(dǎo)膠把果皮粘貼在樣品臺上，粘貼時樣品觀察面朝上。用鍍膜儀鍍金膜，置于掃描電子顯微鏡（SEM）于5 kV加速電壓下觀察拍片。

1.7 相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量的測定

參考Yang等[25]的方法，并稍作修改。用直徑10 mm的打孔器取下10個果皮，蒸餾水清洗3次，用濾紙吸干，將果皮置于試管，加入20 mL去離子水，浸泡30 min測定溶液的初始電導(dǎo)率C0；再將大試管放到沸水浴中30 min，快速冷卻，測定溶液的電導(dǎo)率C1。相對電導(dǎo)率以煮沸前后的相對電導(dǎo)率比值表示。

參考Zhang等[26]的方法，并稍作修改。稱取1.0 g果皮樣品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，研磨勻漿，按10 000 r/min離心15 min，收集上清液。取2.0 mL上清液（對照空白管中加入2.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混勻后在沸水浴中20 min，取出冷卻后離心。取上清液分別測定A450，A532和A600的吸光度。結(jié)果以μmol/g表示。

1.8 ATP，ADP和AMP含量和能荷（EC）的測定

參考Lin等[27]的方法，并稍作修改。取2.0 g果皮加入預(yù)冷的5 mL 0.6 mol/L高氯酸研磨后提取20 min，于4 ℃下，以12 000 r/min離心15 min。取3 mL上清液，用1 mol/L KOH將pH調(diào)至6.5~6.8，定容稀釋到4 mL后用0.45 μm微孔濾膜過濾。ATP、ADP、AMP含量采用安捷倫1260高效液相色譜測定，分析柱采用C18反相柱（250 mm×4.6 mm，phenomenex，Luna，LC），二極管陣列檢測器，測定波長為254 nm，進(jìn)樣體積20 μL，流速0.8 mL/min。流動相A為磷酸鹽緩沖液，包含0.03 mol/L K2HPO4和0.02 mol/L KH2PO4，用0.1 mol/L KOH調(diào)節(jié)至pH 7.0，流動相B為甲醇。采用梯度洗脫，條件為0 min，100% A；7 min 80∶20（A∶B）；9 min，75∶25（A∶B）；10 min 100% A。最后延遲5 min恢復(fù)基線平衡。ATP、ADP、AMP含量通過外標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比對。AXP=ATP+ADP+AMP。按式（3）EC計算。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan多重范圍檢驗確定均值之間的差異（p＜0.05）。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲存溫度下香蕉果實冷害指數(shù)的變化

冷害是指0 ℃以上的不適低溫對冷敏性果蔬在低溫脅迫下造成的一種不良反應(yīng)。從表1可以看出，在整個儲藏階段，5 ℃儲存條件下香蕉果實從第3天開始出現(xiàn)冷害癥狀，表皮出現(xiàn)輕微的水漬狀斑點，此時冷害指數(shù)為11.1%；隨著儲存時間的增加冷害程度加重，貯藏12 d時香蕉果實冷害癥狀表現(xiàn)嚴(yán)重，并且伴隨出現(xiàn)水漬，斑點等癥狀，此時冷害指數(shù)為96.3%；13 ℃儲存條件下香蕉果實在第9天出現(xiàn)輕微冷害癥狀，伴隨根部果皮顏色發(fā)黑，此時冷害指數(shù)為6.3%；而25 ℃儲存條件下的香蕉果實未發(fā)生冷害，但貯藏12 d時果實已經(jīng)出現(xiàn)輕微腐爛。

表1 不同貯存溫度下香蕉果實的冷害指數(shù)

2.2 不同儲存溫度下香蕉果實呼吸速率和表皮結(jié)構(gòu)的變化

如圖2所示，不同儲存溫度下的香蕉果實在儲存初期呼吸速率降低，可能是適應(yīng)新環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)；儲存中期呼吸速率升高，可能是香蕉果實出現(xiàn)呼吸躍變，Lin等[28]對桂圓果實和Chen等[29]對龍眼果實的研究中也出現(xiàn)呼吸躍變。此外，由圖2可知，低溫貯藏沒有推遲呼吸躍變的出現(xiàn)。5 ℃儲存條件下香蕉果實的呼吸速率顯著低于13 ℃和25 ℃儲存條件下的呼吸速率，這一結(jié)論與蘇新國等[30]對香蕉果實的研究結(jié)果相似，這表明低溫會抑制香蕉的呼吸作用。

圖2 不同的儲存溫度下香蕉果實的呼吸速率

掃描電鏡觀察表明（圖3），在貯藏初期（第0天），香蕉果皮沒有冷害，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞飽滿，排列整齊有序，表面光滑無皺紋和裂紋，結(jié)構(gòu)清晰，氣孔開放程度較?。ˋ1，A2，A3）；在貯藏中期（第6天），5 ℃儲存條件下果實發(fā)生中度冷害，表皮細(xì)胞收縮，有序性下降（B1），25 ℃和13 ℃儲存條件下表皮出現(xiàn)輕微的皺紋和裂紋，氣孔開放程度變大（B2，B3）；在儲存后期（第12天），5 ℃儲存條件下香蕉果實冷害變得非常嚴(yán)重，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞皺縮（C1），25 ℃和13 ℃儲存條件下香蕉果實表皮分裂成唇狀突起形成皮孔，并且裂紋的長度和寬度增加，氣孔收縮（C2，C3）。此外，在儲藏初期氣孔開放程度較小，儲藏中期氣孔開放程度變大，儲藏后期氣孔收縮的現(xiàn)象與呼吸速率變化趨勢一致。

圖3 香蕉在儲存過程的掃描電子顯微鏡圖像

2.3 不同儲存溫度下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化

冷害是造成細(xì)胞膜損傷的主要原因之一，相對電導(dǎo)率可反映果皮細(xì)胞膜的破壞程度。果蔬發(fā)生冷害時，細(xì)胞膜的通透性會增加甚至完全喪失，膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，相對電導(dǎo)率變大，膜脂過氧化程度加劇，而相對電導(dǎo)率越大，則細(xì)胞膜的完整性破壞越嚴(yán)重[31]。如圖4所示，25 ℃貯藏條件下香蕉果皮電導(dǎo)率從第6天開始顯著升高，此時香蕉的外觀表現(xiàn)出黃化、伴隨褐變斑點出現(xiàn)，這可能是貯藏過程中果皮的衰老導(dǎo)致相對電導(dǎo)率升高[32]；13 ℃貯藏條件下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率處于較低水平；5 ℃貯藏條件下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率變化趨勢顯著，在第12天增加74%，這可能是冷害引起了細(xì)胞膜損傷，致使電解質(zhì)外滲[33]。

圖4 不同的儲存溫度下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率

ATP缺乏會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，MDA作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量常用來表示果蔬衰老或冷害過程中細(xì)胞膜的膜脂過氧化程度和逆境傷害程度[34-35]。從圖5可以看出，5 ℃儲存條件下香蕉果皮的MDA含量顯著高于其他兩個儲存條件下（p＜0.05），這可能是冷藏導(dǎo)致香蕉果皮的ATP和EC降低，從而導(dǎo)致能量代謝紊亂的結(jié)果[36]；13 ℃儲存條件下的MDA含量緩慢上升，這可能是充足的ATP和EC供應(yīng)保護(hù)膜完整性的結(jié)果[34]；而25 ℃儲存條件下香蕉果皮MDA含量在儲藏后期上升，可能是由于貯藏溫度較高，促使了膜脂過氧化反應(yīng)速率加快。

圖5 不同的儲存溫度下香蕉果皮的丙二醛

2.4 不同儲存溫度下香蕉果皮ATP、ADP、AMP和能荷的變化

不同的儲存溫度下香蕉果皮ATP（D1），ADP（D2），AMP（D3），AXP（D4）含量和能量電荷（D5）如圖6所示。能量是生命活動的基礎(chǔ)，能量狀態(tài)與生物學(xué)特性密切相關(guān)[37]。一般而言，無論儲存溫度的高低，果蔬的ATP和ADP含量均出現(xiàn)隨儲存時間的增加而逐漸降低的趨勢[6]。如圖6所示，在儲存前期，香蕉果皮的ATP，ADP和EC含量較高（D1，D2，D5），而磷酸腺苷（AMP）的含量相對較低（D3）；隨著儲存時間的增加，ATP，ADP和EC的含量降低，AMP的含量增加。5 ℃儲存條件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的下降幅度明顯高于其他組（p＜0.05），在第12天，5 ℃儲存的果皮顯示出最低的ATP和ADP含量，這一趨勢與Chen等[38]對桃果實的研究得到相似的結(jié)果；13 ℃儲存條件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的顯著高于其他組（p＜0.05），在第12天儲存結(jié)束時，13 ℃儲存條件下香蕉果皮顯示出最高的ATP和ADP含量。

圖6

此外，隨著溫度的降低和保存時間的延長，5 ℃儲存條件下香蕉果皮總腺苷核苷酸顯著減少（p＜0.05）。因此，低溫不僅減少了香蕉果皮中的EC數(shù)量，而且由于總腺嘌呤核苷酸的減少導(dǎo)致ATP的數(shù)量的減少，可能進(jìn)一步加劇香蕉果皮冷害癥狀[6]。

3 結(jié)論

5 ℃下的香蕉果實 ATP、ADP含量和EC值最低，呼吸速率最低，細(xì)胞能量虧缺最嚴(yán)重，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量最高，其存在典型的凍害癥狀，如褐變，水漬斑點和凹陷。13 ℃貯藏香蕉果實保持最高的能量水平，呼吸速率較高，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量最較低，在第9天出現(xiàn)冷害癥狀。表明香蕉果實冷害發(fā)生與能量虧缺有密切關(guān)系，較高的能量水平有助于減輕冷害。