周鑫，王雪松，谷守國(guó)，張淼怡，葛凱，鄭百芹*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）

牛奶等乳制品具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在世界各地都有消費(fèi)[1]。一些乳企使用奶粉溶解在水中制成復(fù)原乳，將其冒充生鮮乳作為原料生產(chǎn)加工成商品奶出售給消費(fèi)者，但未加復(fù)原乳標(biāo)識(shí)，進(jìn)而損害消費(fèi)者利益[2]?？钒彼崾窃诿览路磻?yīng)早期階段形成的化合物，而生鮮乳中缺乏糠氨酸[3-4]；濃縮牛奶和奶粉通常是通過熱處理獲得，糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化受到乳品及生產(chǎn)加工過程中熱處理程度的影響，因而糠氨酸可用于評(píng)價(jià)乳品的熱加工程度[5]。NY/T 939—2016也將糠氨酸作為巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳鑒定的重要指標(biāo)之一[6]。

檢測(cè)液態(tài)奶中糠氨酸的方法較多，其中包括液相色譜法[7-9]、紫外分光光度法[10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、毛細(xì)管電泳法[13]等，這些測(cè)定方法均能對(duì)液態(tài)奶中的糠氨酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。試驗(yàn)針對(duì)不同品牌的奶粉進(jìn)行溶解，分別以不同比例摻入生鮮乳中，經(jīng)巴氏殺菌，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)殺菌后的乳液進(jìn)行糠氨酸含量的測(cè)定，旨在應(yīng)用該方法提升對(duì)于復(fù)原乳摻入生鮮乳的比例下限的辨識(shí)度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；API 4000 Q trap三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；Kjeltec8400凱氏定氮儀（丹麥Foss公司）；干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，DHG-9240A）；固相萃取柱：PLS小柱（200 mg/6 mL，Dikma公司）；微孔濾膜（0.22 μm，Dikma公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品糠氨酸（CAS號(hào)19746-33-9，德國(guó)Iris公司）；牛奶和奶粉樣品（市售）；甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純；試驗(yàn)用水為自制超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量糠氨酸對(duì)照品，用3 mol/L鹽酸溶解并定容，配制成50 mg/mL的糠氨酸儲(chǔ)備液，在-18 ℃條件下保存。使用時(shí)，根據(jù)需求稀釋成合適濃度。

1.3 樣品處理

稱取不同品牌的奶粉各25 g，分別加入180 mL 45℃超純水，充分溶解，回復(fù)至室溫備用。分別在生鮮乳中摻入0，5%，10%，15%，20%，40%，60%，80%和100%的復(fù)原乳，充分混勻[14-15]。將樣品置于63℃水浴中預(yù)熱30 min，后置于75 ℃水浴中30 s，回復(fù)至室溫備用[16]。

1.4 超高效液相色譜法測(cè)定糠氨酸

參照NY/T 939—2016測(cè)定糠氨酸。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定糠氨酸

準(zhǔn)確吸取2.00 mL試樣于耐熱耐壓螺口試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，封閉試管，在110 ℃烘箱中加熱水解16 h。待試管冷卻至室溫后，搖勻水解液并過濾，收集濾液備用。用3 mL甲醇和3 mL水活化、平衡固相萃取柱，取1.0 mL濾液過柱上樣，用2.0 mL水洗脫，收集洗脫液并定容到2.0 mL，取0.5 mL洗脫液，用甲醇稀釋100倍，取適量過膜待上機(jī)。

色譜柱，ACQUITY BEH HILIC液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B，乙腈。洗脫方式為梯度洗脫，洗脫條件：0~0.5 min，5% A；0.5~1.0 min，5% A升至45% A；1.0~2.2 min，保持45% A；2.2~2.3 min，45%A下降到5% A；2.3~3.5 min，保持5% A。

離子源，電噴霧（ESI+）；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；霧化氣（GS1）40 psi；輔助氣30 psi（GS2）；碰撞氣（CAD），Medium；源溫550 ℃；噴霧電壓（IS）5 000 V；入口電壓（EP）10 V?？钒彼岜O(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）參數(shù)見表1。

表1 糠氨酸的選擇離子及碰撞能量

1.6 水解液中蛋白含量測(cè)定

參照GB 5009.5—2016測(cè)定蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 液質(zhì)聯(lián)用法基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是樣品中除分析物以外的組分對(duì)分析物的分析過程造成的干擾和影響。在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中，受到基質(zhì)中其他組分競(jìng)爭(zhēng)電離的影響，目標(biāo)化合物的電離程度往往會(huì)受到抑制，相應(yīng)值下降。分別使用溶劑和空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別上機(jī)檢測(cè)，利用線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME），如式（1）所示。

ME=（slopem/slopes-1）×100% （1）式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；slopem為基質(zhì)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；slopes為溶劑標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。計(jì)算ME的數(shù)值，根據(jù)其范圍判斷基質(zhì)效應(yīng)的大小程度。ME=-27.5%（見圖1和表2），表明目標(biāo)化合物離子化受到抑制，并屬于中等基質(zhì)效應(yīng)[17]。為消除或減小基質(zhì)效應(yīng)給試驗(yàn)定量分析帶來的誤差，采用基質(zhì)標(biāo)對(duì)牛奶樣品進(jìn)行定量分析。

圖1 有機(jī)溶劑配制糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 空白基質(zhì)配制糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 液質(zhì)聯(lián)用法與液相法測(cè)定糠氨酸結(jié)果比較

采用NY/T 939—2016中超高效液相色譜法和試驗(yàn)介紹的液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)糠氨酸定量分析進(jìn)行比較，2種方法的糠氨酸特征峰色譜圖見圖3和圖4。結(jié)果顯示，糠氨酸在2種檢測(cè)方法中均有較好的峰型，這有助于對(duì)糠氨酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

圖3 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 μg/mL）色譜圖（UPLC）

圖4 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 μg/mL）MRM色譜圖

選取同一超高溫滅菌乳樣品，分別用超高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)糠氨酸進(jìn)行測(cè)定分析，比較2種方法的測(cè)定結(jié)果，2組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，如表2所示。說明試驗(yàn)所應(yīng)用的液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定糠氨酸是穩(wěn)健、可靠的。

表2 超高效液相法和液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定糠氨酸方差分析

2.3 巴氏殺菌乳中的復(fù)原乳測(cè)定

選取不同品牌的奶粉N、奶粉A、奶粉L，加水溶解為復(fù)原乳。將得到的3種品牌奶粉的復(fù)原乳按照0，5%，10%，15%，20%，40%，60%，80%和100%的比例添加到生鮮乳中，經(jīng)過巴氏殺菌加熱，使用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)處理后的樣品糠氨酸參數(shù)的測(cè)定，結(jié)果見圖4和表3。

一般來說，生鮮乳和巴氏殺菌乳中的糠氨酸含量較低，不高于15 mg/100 g蛋白質(zhì)[5]，試驗(yàn)中3種品牌復(fù)原乳添加0點(diǎn)的巴氏殺菌乳的數(shù)值分別10.08，10.45和9.93 mg/100 g蛋白質(zhì)，與文獻(xiàn)中數(shù)值范圍一致，沒有顯著性差異（p=0.769），說明同一未添加復(fù)原乳的生鮮乳在經(jīng)過巴氏殺菌后，在批次間沒有差異，加熱過程和測(cè)定方法穩(wěn)定。

由圖5可知，隨著生鮮乳中復(fù)原乳摻入比例增大，糠氨酸含量呈線性升高，摻入比100%時(shí)，即復(fù)原乳經(jīng)巴氏殺菌加熱后的糠氨酸含量最高，3種復(fù)原乳N、A、Y中糠氨酸含量分別為254.84，190.99和188.40 mg/100 g 蛋白質(zhì)，差異主要來源于奶粉本身糠氨酸的含量及奶粉的存儲(chǔ)時(shí)間[18]，致使摻入復(fù)原乳N的樣品組形成的擬合曲線斜率要大于另兩組。

圖5 摻入不同比例復(fù)原乳的巴氏殺菌乳糠氨酸含量

在復(fù)原乳N、A、Y每個(gè)摻入比設(shè)定點(diǎn)做3個(gè)平行重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定糠氨酸含量，并求出其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，利用方差分析考察摻入復(fù)原乳比例對(duì)糠氨酸測(cè)定值的影響程度，如表3所示。通過方差分析研究摻入比例對(duì)于復(fù)原乳N、復(fù)原乳A、復(fù)原乳Y共3項(xiàng)的差異性，結(jié)果表明，不同比例樣本對(duì)于糠氨酸含量均呈現(xiàn)出顯著性差異（p＜0.05），表明3種品牌的奶粉溶解制成的復(fù)原乳，摻入比例達(dá)到5%，即與常規(guī)巴氏殺菌乳有顯著不同，能夠辨別出在加工過程中加入復(fù)原乳。

表3 糠氨酸含量方差分析

牛奶在乳制品工業(yè)中經(jīng)過熱處理，以確保微生物安全和延長(zhǎng)保質(zhì)期。不同類型的熱處理可以影響牛奶的感官、理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[19]。試驗(yàn)對(duì)生鮮乳巴氏殺菌摻入復(fù)原乳的情況進(jìn)行研究，得到摻入5%復(fù)原乳即與生鮮乳有不同結(jié)果；生鮮乳的超高溫滅菌程度要高于巴氏殺菌，如改變殺菌條件，測(cè)定其各摻入比例點(diǎn)的糠氨酸含量，可能得到斜率更低的樣品回歸曲線，使得復(fù)原乳摻入的低比例點(diǎn)相互之間的差異性降低。

接表3

3 結(jié)論

通過對(duì)比液質(zhì)聯(lián)用法和超高效液相色譜法測(cè)定牛奶中糠氨酸含量，對(duì)液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定糠氨酸含量的穩(wěn)定性進(jìn)行確認(rèn)。生鮮乳經(jīng)由不同品牌奶粉溶解成的復(fù)原乳按照不同比例摻入后進(jìn)行巴氏殺菌加熱，測(cè)定糠氨酸含量。結(jié)果表明，隨著摻入復(fù)原乳比例增大，其糠氨酸含量呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)；3種復(fù)原乳在摻入5%后，巴氏殺菌乳的糠氨酸含量均有顯著提高。因此應(yīng)用試驗(yàn)所述的液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定巴殺奶中的糠氨酸，最低能辨別到5%的復(fù)原乳添加量，為巴氏殺菌乳中復(fù)原乳的分析提供方法。