王巖松，賀明睿*，王冬妍，閆曉梅，羅景陽，袁帥

1. 沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所（沈陽 110124）；2. 沈陽化工大學(xué)（沈陽 110142）

吡氟草胺屬于類胡蘿卜素生物合成抑制劑，是廣譜的選擇性麥田除草劑，施藥后抑制類胡蘿卜素的生物合成，使植物產(chǎn)生脫色現(xiàn)象，并間接地破壞光合作用，導(dǎo)致植物死亡[1]。吡氟草胺的毒性較強(qiáng)，在GB 2763—2019[2]中規(guī)定小麥中限量為0.05 mg/kg。目前，吡氟草胺的檢測方法主要有氣相色譜法[3]、液相色譜法[4-5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6-7]和液相串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]等。液相串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)，二級質(zhì)譜掃描定量可以降低假陽性的誤判概率的優(yōu)點(diǎn)。

分子印跡技術(shù)[11-17]是模仿抗原-抗體原理而人工合成的對模板分子在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)形成具有“記憶功能”的高分子聚合物（MIP）的技術(shù)。MIP的特異吸附性逐漸被發(fā)掘并應(yīng)用于生物傳感器、化合物的提取、純化、色譜分離等領(lǐng)域。分子印跡固相萃取成功地將MIP的特性融入到固相萃取的技術(shù)中，為復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的提取、分離尋找到新的解決途徑。

以吡氟草胺為模板分子，2-（三氟甲基）丙烯酸（TFMAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，成功制備了D-MIP，研制了吡氟草胺固相萃取小柱，應(yīng)用于谷物中吡氟草胺殘留量的檢測。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 4000，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；液相色譜儀（LC 20A，日本島津公司）；電子天平（BS244S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2，余姚市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市英峪予華儀器制造廠）；臺(tái)式離心機(jī)（800-1，金壇區(qū)西城區(qū)新瑞儀器廠）；恒溫水浴振蕩器（SHA-B，國華企業(yè)）；電子萬用爐（DL-1，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；掃描電鏡（FEI NOVA NanoSEM 450，F(xiàn)EI公司）。

吡氟草胺（95%，沈陽化工研究院）；福美雙（98%，沈陽化工研究院）；無水乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；TFMAA（98%，阿拉?。籄IBN（98%，麥克林）；EGDMA（98%，阿拉丁）；鹽酸（分析純，國藥有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。

1.2 D-MIP的制備

準(zhǔn)確稱取0.394 g 吡氟草胺于250 mL三角瓶中，加入100 mL乙腈至完全溶解后加入一定量的TFMAA室溫預(yù)聚12 h，依次加入5 mL EGDMA、0.5 mmol AIBN超聲5 min，持續(xù)充入氮?dú)?0 min，封口，在60 ℃磁力攪拌24 h，取出制備的白色聚合物置于索氏提取器中，用60 mL無水乙醇-乙酸（8∶2，V/V）提取6 h，反復(fù)多次用甲醇-水（1∶1，V/V）超聲洗脫至洗脫液為中性，然后用甲醇洗脫，至LC-MS/MS檢測不到吡氟草胺分子為止，將聚合物置于60 ℃烘箱中烘干，得到吡氟草胺分子印跡聚合物，置于干燥器中備用。

非分子印跡聚合物（D-NIP）的制備步驟除不添加吡氟草胺，其余與D-MIP制備方法一致。

1.3 D-MIP的吸附性能測試

1.3.1 LC-MS/MS檢測的條件

Symmetry C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇，分別添加0.1%的甲酸；線性梯度洗脫程序：0~1.5 min為20% B，1.5~3 min由20% B變?yōu)?5% B，3~4.5 min為95% B，4.5~5 min由95% B變?yōu)?0% B，5~7 min保持20% B。流速0.35 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

電噴霧離子源（Electron spray ionization，ESI），正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓（Ionspray voltage，IS）5 500 V；霧化氣壓力65 psi（1 psi=6 894.76 Pa）；氣簾氣壓力15 psi；輔助氣壓力65 psi；離子源溫度550 ℃；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量（Collision energy，CE）及去簇電壓（Declustering Potential，DP）見表1。

表1 吡氟草胺、福美雙的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 mg D-MIP和D-NIP，各7份，分別置于10 mL塑料離心管中，加入5 mL吡氟草胺溶液（10 mg/L）于30 ℃恒溫水浴振蕩。不同時(shí)間間隔同時(shí)取出1份D-MIP和D-NIP，離心后取100 μL上清液置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。以10，20，30，40，50，60和80 min時(shí)的吸附量Q與吸附時(shí)間t作圖，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。吸附量按式（1）計(jì)算。

式中：Q為吸附量，μg/g；V為吡氟草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C0為吡氟草胺的初始質(zhì)量濃度，ng/mL；C1為吸附后吡氟草胺的質(zhì)量濃度，ng/mL；W為D-MIP或D-NIP的質(zhì)量，mg。

1.3.3 靜態(tài)平衡吸附試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 mg D-MIP和D-NIP，各6份，置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL 2，4，6，8，10和12 μg/mL的吡氟草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在30 ℃下恒溫振蕩50 min，然后離心，取100 μL上清液置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。以吸附量Q與吡氟草胺濃度C作圖，繪制等溫吸附曲線。

1.3.4 D-MIP選擇性吸附試驗(yàn)

取2份20 mg D-MIP置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL 10 μg/mL的吡氟草胺、福美雙水溶液，恒溫振蕩50 min，供LC-MS/MS測定。比較MIP對2種化合物的吸附性能。

1.4 D-MIP小柱的制備及驗(yàn)收

1.4.1 D-MIP小柱的制備

D-MIP小柱的制備過程如圖1所示。去空柱裝入塞板1，加入100 mg的D-MIP，均勻覆蓋在塞板1表面，裝入塞板2確保聚合物厚度均勻一致后壓實(shí)，塞板平面必須與柱體垂直。

圖1 D-MIP小柱的裝柱過程

1.4.2 D-MIP柱容量和回收率試驗(yàn)

D-MIP柱的活化：依次用5 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）、5 mL水過柱活化。

取吡氟草胺質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μg/mL水溶液各10 mL，分別過活化后的6根D-MIP柱，用5 mL水淋洗和6 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）洗脫，洗脫液稀釋至10~1 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍后過0.22 μm有機(jī)濾膜，供LC-MS/MS定量分析。繪制上柱吡氟草胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量與回收率曲線。當(dāng)回收率低于80%時(shí)，上柱的量定為D-MIP凈化柱的柱容量（試驗(yàn)在室溫下操作）。

1.5 D-MIP小柱在谷物中吡氟草胺殘留量檢測中的應(yīng)用

1.5.1 提取

試驗(yàn)選用大米、玉米、燕麥3種谷物樣品進(jìn)行試驗(yàn)。稱取500 g谷物樣品，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過0.850 mm（20目）孔徑篩，混勻，密封，標(biāo)記備用。稱取10.00 g粉碎樣品置于50 mL離心管中，加入5 g無水硫酸鈉，再加入10 mL乙腈振蕩30 min、超聲5 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL離心管中，殘?jiān)儆?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液。上清液經(jīng)氮?dú)獯抵两?，? mL水（1%甲酸）溶解待凈化。

1.5.2 凈化

提取液上活化后的D-MIP小柱凈化，經(jīng)5 mL水淋洗，6 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯抵两桑? mL甲醇定容，供LC-MS/MS定量分析。

1.5.3 方法學(xué)驗(yàn)證

對采用D-MIP柱凈化的方法進(jìn)行驗(yàn)證，包括方法的靈敏度、線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度等參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合反應(yīng)條件對吸附性能的影響

2.1.1 聚合反應(yīng)條件的確定

試驗(yàn)優(yōu)化了致孔劑（乙腈）、功能單體（TFMAA）、交聯(lián)劑（EGDMA）和引發(fā)劑（AIBN）的用量及配比。100 mL乙腈中加入3 mmol/L TFMAA，在室溫預(yù)聚12 h，依次加入25 mmol/L EGDM和0.5 mmol/L AIBN，在60 ℃下聚合反應(yīng)24 h。物料在上述比例及反應(yīng)條件下，制得的聚合物產(chǎn)率最高，聚合物呈白色顆粒狀粉末，在圖2（a）中清晰可見聚合物呈空間立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.1.2 模板分子與功能單體的比例對吸附性能的影響

在保持上述聚合反應(yīng)條件不變的情況下，改變模板分子的加入量，制得D-MIP的SEM圖。由圖2可知，當(dāng)模板分子加入量的比例為1∶5時(shí)，制得的聚合物團(tuán)聚在一起，沒有形成空間分散均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不利于模板分子的洗脫，影響聚合物吸附能力。隨著模板分子量的增加，聚合物的粒徑逐漸減小，呈現(xiàn)出空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)模板分子的比例達(dá)到1∶3時(shí)，聚合物呈稀松的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒表面粗糙，顆粒之間形成大量的孔隙，推測適當(dāng)比例的模板分子通過靜電吸附、氫鍵作用等在聚合物顆粒之間撐開較大的孔隙，形成大量的空間結(jié)合位點(diǎn)，模板分子被洗脫出去后在孔隙間留下具特異吸附性的結(jié)合位點(diǎn)。但是隨著模板分子的量繼續(xù)增加，聚合物顆粒表面變得光滑，粒徑增大，孔隙明顯減少，推測可能是模板分子相互作用降低了聚合物中形成孔穴的概率。因此，模板分子與功能單體的比例選擇1∶3。

圖2 不同比例模板分子與功能單體聚合物的SEM圖片（5 μm）

2.1.3 D-MIP的吸附性能

2.1.3.1 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

聚合物隨著吸附時(shí)間的增加，吸附在聚合物表面和孔隙間的吡氟草胺分子數(shù)量增多。如圖3所示：吸附時(shí)間在10~20 min之間，吸附速率最快；在20~50 min之間，吸附量以比較緩慢的速率持續(xù)增大；吸附時(shí)間增加到50 min時(shí)，吸附量達(dá)到飽和狀態(tài)；繼續(xù)延長吸附時(shí)間，吸附量還會(huì)出現(xiàn)略微的降低趨勢。在吸附前期，吡氟草胺分子迅速附著在聚合物顆粒表面，占據(jù)表面的結(jié)合位點(diǎn)，隨著時(shí)間的增加伴及振蕩作用，吡氟草胺分子緩慢地進(jìn)入顆粒間的孔隙，通過具有“記憶功能”的結(jié)合位點(diǎn)，找到適合的位置。隨著時(shí)間繼續(xù)延長，到50 min時(shí)，聚合物表面和顆粒間的位點(diǎn)全部占據(jù)，聚合物達(dá)到最大吸附量，D-MIP最大吸附量為1 350 mg/kg，D-NIP最大吸附量為320 mg/kg。因?yàn)樵贒-NIP表面和顆粒間缺少了這種“記憶功能”的結(jié)合位點(diǎn)，其吸附量明顯低于D-MIP。

圖3 D-MIP和D-NIP對吡氟草胺的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

如圖4所示，D-NIP和D-MIP在放大倍數(shù)逐漸增大的情況下，能更清晰發(fā)現(xiàn)D-NIP顆粒粒徑明顯大于D-MIP顆粒粒徑，圖4（f）中可以看到D-MIP顆粒表面凸凹不平，顆粒間均勻分布大量的孔隙，正因?yàn)镈-MIP顆粒表面的凸凹結(jié)構(gòu)和孔隙，賦予了它良好的吸附性能和特異選擇性。聚合物顆粒的結(jié)構(gòu)分布情況進(jìn)一步證明D-MIP吸附量明顯大于D-NIP。

圖4 不同分辨率D-NIP和D-MIP的SEM圖片

2.1.3.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

保持50 min的吸附時(shí)間，驗(yàn)證聚合物在不同濃度吡氟草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附量變化。如圖5所示，D-MIP和D-NIP均表現(xiàn)出隨著吸附吡氟草胺濃度的升高，吸附量變大的趨勢。D-NIP的吸附曲線比較平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)吸附量突越的現(xiàn)象，D-MIP結(jié)構(gòu)中印跡孔隙和具有特異吸附性的識(shí)別位點(diǎn)與吡氟草胺濃度相匹配，吡氟草胺分子在D-MIP顆粒表面和空隙中迅速占位，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到8 μg/mL時(shí)吸附行為達(dá)到終點(diǎn)，最大吸附量為1 350 mg/kg。X-NIP依靠自身的縫隙和疏松的結(jié)構(gòu)也存在一定的吸附行為，飽和吸附量為320 mg/kg。

2.1.3.3 選擇性吸附試驗(yàn)結(jié)果

在相同的試驗(yàn)條件下，比較D-MIP對吡氟草胺和福美雙分子的吸附能力。結(jié)果顯示：D-MIP對吡氟草胺的吸附量明顯高于福美雙，為1 350 mg/kg；其對福美雙的吸附量為350 mg/kg。再次證明D-MIP結(jié)構(gòu)中形成的“記憶”孔隙和識(shí)別位點(diǎn)只與吡氟草胺分子相匹配，與福美雙的分子結(jié)構(gòu)不具有識(shí)別功能。

2.2 D-MIP凈化柱性能試驗(yàn)結(jié)果

凈化柱的柱容量是指凈化柱對一種或多種溶質(zhì)可容納的最大量。試驗(yàn)比較D-MIP凈化柱中D-MIP粉末的裝柱質(zhì)量對吸附性能的影響。當(dāng)裝柱質(zhì)量較少時(shí)，柱容量較低，在淋洗過程容易損失目標(biāo)物，限制小柱的應(yīng)用。D-MIP粉末的裝柱質(zhì)量也不宜過多，否則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物不易洗脫出來，增加甲醇的用量。綜合考慮，D-MIP粉末的裝柱質(zhì)量選擇100 mg。

試驗(yàn)選用吡氟草胺質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μg/mL水溶液各10 mL分別過D-MIP凈化柱，經(jīng)LC-MS/MS定量分析，計(jì)算不同濃度點(diǎn)的回收率，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)吡氟草胺上柱量在100 μg以下時(shí)，回收率保持在90%以上；當(dāng)上柱量超過135 μg時(shí)，回收率降低至80%以下。為保證凈化柱的良好性能，確定100 μg為D-MIP凈化柱的柱容量。

圖5 D-NIP和D-MIP的靜態(tài)吸附曲線

圖6 吡氟草胺溶液過柱后的回收率

2.3 D-MIP凈化柱在谷物中吡氟草胺檢測方法中的應(yīng)用

將分子印跡固相萃取小柱用于大米、玉米和燕麥等谷物樣品中吡氟草胺殘留量的檢測，優(yōu)化前處理?xiàng)l件和D-MIP凈化柱的活化、淋洗和洗脫等步驟。色譜條件和質(zhì)譜條件按照1.3.1節(jié)。吡氟草胺和福美雙質(zhì)量濃度為10 μg/L的MRM色譜圖如圖7所示。

圖7 吡氟草胺與福美雙的MRM色譜圖

由表2可知，3種基質(zhì)中吡氟草胺的定量限均為0.1 μg/kg，在0.1~20 μg/kg線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性關(guān)系系數(shù)r≥0.999 0。當(dāng)3種基質(zhì)中的添加濃度分別為0.1，0.5和5 μg/kg時(shí)，其平均回收率在89.6%~102.9%之間（n=6），平均精密度SRSD為4.41%。

表2 不同基質(zhì)中吡氟草胺的相對回收率、精密度和線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用本體聚合法，乙腈為致孔劑，TFMAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，制備吡氟草胺的分子印跡聚合物，D-MIP的最大吸附量為1 350 mg/kg。應(yīng)用D-MIP研制出分子印跡固相萃取小柱，凈化柱具有較好的吸附性能，柱容量達(dá)到100 μg/100 mg。

應(yīng)用D-MIP凈化柱，建立谷物中吡氟草胺殘留量的檢測方法。該方法具有較高的靈敏度，定量限為0.1 μg/kg。當(dāng)大米、玉米和燕麥基質(zhì)中的添加濃度分別為0.1，0.5和5 μg/kg時(shí)，其平均回收率在89.6%~102.9%之間（n=6），平均精密度SRSD為4.41%，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。