洪澤淳，陳思敏，鄭悅珊，劉瑩瑩，李南，熊含鴻*

廣東省食品檢驗所（廣州 510435）

韭菜在中國是一種普遍食用的蔬菜，在蔬菜生產(chǎn)和供應中占有重要位置，其生長周期短，生產(chǎn)過程中病蟲害較多，各種農(nóng)藥的使用不可避免[1]。韭菜中的農(nóng)藥多殘留檢測一直是農(nóng)殘分析領域關注的難點問題，因為韭菜中含大量有機硫化合物和辛辣物質(zhì)，會在樣品粉碎時釋放大量烯丙基甲基二硫醚、二甲基二硫醚和二丙烯基三硫醚等揮發(fā)性成分[2-3]，這些化合物與有機磷農(nóng)藥性質(zhì)相似，在氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）、氣相色譜-火焰光度檢測器（GCFPD）和氣相色譜-質(zhì)譜檢測器（GC-MS）上會產(chǎn)生很強的響應[4]，加上韭菜提取液中色素含量較高，基質(zhì)背景非常復雜，會嚴重干擾對韭菜中殘留農(nóng)藥的定性、定量分析。

農(nóng)藥多殘留的檢測方法很多，有氣相色譜（GC）法[5]、液相色譜（LC）法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法[7]、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法[8]，與其他方法相比，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）法具有氣相色譜的高分離效能，又具有質(zhì)譜（二級質(zhì)譜）可鑒定化合物結構的特點，選擇性強、靈敏度高，能有效地降低基質(zhì)干擾，為化合物的測定提供準確豐富的結構信息，特別適用于背景干擾嚴重、定性困難的樣品分析，可同時快速測定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物[9-12]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）是近年來發(fā)展起來的一種前處理技術，具有分析速度快、操作簡單、回收率較高和價格低廉的優(yōu)點，被廣泛應用于農(nóng)殘檢測[13-15]。通過改進的QuEChERS前處理方法結合GC-MS/MS技術分析韭菜中多種農(nóng)藥殘留，充分發(fā)揮二者快速準確的特點，既簡化樣品的前處理，又有效避免基質(zhì)干擾，能進行準確定性定量，適合大批量韭菜樣品中多種農(nóng)藥殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8040三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；Reeko AutoEVA-60型氮吹儀（?？苾x器有限公司）；IKA T25數(shù)顯型均質(zhì)機（艾卡（廣州）儀器設備有限公司）；Multi-Tube Vortexer多管漩渦混合儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；Thermo ST8型離心機（賽默飛世爾科技公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；丙酮（色譜純）、無水硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）（廣州化學試劑廠）；石墨化炭黑（GCB）粉末、N-丙基乙二胺（PSA）粉末、C18粉末（日本島津公司）；萃取鹽包（主要成分為4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，日本島津公司）；試驗用水為超純水（德國Merck公司）。

韭菜樣品（市售）。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液：滅多威、敵敵畏、異丙威、治螟磷、甲拌磷、樂果、克百威、地蟲硫磷、甲基毒死蜱、3-羥基克百威、甲霜靈、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、甲基異柳磷、噻菌靈、α-硫丹、苯線磷、丙溴磷、β-硫丹、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

標準工作溶液：22種農(nóng)藥標準溶液用丙酮稀釋配制成5.0 μg/mL的混合標準溶液，使用時以乙酸乙酯稀釋至一定濃度進行氣相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，用空白樣品基質(zhì)稀釋混合標準溶液，制備成0，5，10，20，50和100 μg/L的基質(zhì)混合標準工作溶液。

內(nèi)標溶液：準確稱取3.5 mg環(huán)氧七氯于100 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，得到5.0 μg/mL的內(nèi)標溶液。

1.3 樣品前處理

提?。簶悠方?jīng)粉碎勻漿后，稱取10 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈、萃取鹽包（4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉）和1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，漩渦混合振蕩3 min后按8 000 r/min離心5 min，上層乙腈層待凈化。

凈化：吸取6 mL乙腈層溶液加到內(nèi)含885 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA及15 mg GCB的15 mL塑料離心管中。漩渦混合振蕩3 min后按8 000 r/min離心5 min，準確吸取2 mL上清液，于40 ℃水浴氮吹至近干，加入20 μL內(nèi)標溶液，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后，上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

VF-1701色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣，He；線速度47.2 cm/s；總流量30.0 mL/min；色譜柱流量1.69 mL/min；色譜柱溫度50 ℃；溫度程序：50 ℃（保持1 min），25 ℃/min升至125 ℃（保持0 min），以10 ℃/min升至300 ℃（保持1 min）；進樣模式，不分流；進樣量1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源采用EI源，70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲1.5 min；CID氣，氬氣；檢測器電壓（相對于調(diào)諧結果）0.60 kV；數(shù)據(jù)采集模式采用多反應監(jiān)測（MRM）。

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇常用的22種農(nóng)藥（有機磷、有機氯、菊酯類、氨基甲酸酯類等）進行方法學的研究考察。在全掃描模式下進行掃描，獲得各化合物的保留時間和特征母離子，再進行子離子掃描，選擇豐度較高、質(zhì)荷比較大、特征性強的離子作為子離子，同時優(yōu)化各化合物的碰撞能量。按照各化合物的出峰時間窗口特點及需要監(jiān)測離子的出峰順序，分時段分別監(jiān)測，同時控制每個時間段內(nèi)監(jiān)測的離子數(shù)目和駐留時間，確保目標化合物在設定的掃描時間窗口出峰，且具有足夠的數(shù)據(jù)采集點。22種農(nóng)藥的保留時間、定量定性的離子對以及碰撞電壓參數(shù)如表1所示。

表1 22種農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

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2.2 提取溶劑的選擇

由于農(nóng)藥品種多，結構差異大且極性范圍廣，選擇萃取溶劑時應綜合考慮提取溶劑的性質(zhì)需與目標化合物相符，且目標化合物在其中有良好的可溶性和穩(wěn)定性。在農(nóng)藥多殘留分析中，常用的提取溶劑有丙酮、乙腈和乙酸乙酯。丙酮的水溶性強，作為提取溶劑時，分層效果不明顯，難以實現(xiàn)有機溶劑與水完全分離，鹽析效果不如乙腈。乙腈的通用性較強，對多數(shù)農(nóng)藥均具有較高的提取效率，且乙腈極性較大，對基質(zhì)中的一些非極性的雜質(zhì)如油脂、蠟質(zhì)和葉綠素等提取較少，在去除雜質(zhì)方面效果較好。乙酸乙酯對農(nóng)藥的提取效率高，但容易將一些非極性親脂性的雜質(zhì)提取出來，與乙腈相比雜質(zhì)較多，干擾較大[16-18]。綜合考慮，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

農(nóng)藥殘留檢測中常用的凈化劑有PSA、GCB和C18。PSA材料的有效成分為其表面鍵合的氨基，它對于樣品中的金屬離子、糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性物質(zhì)具有良好的凈化作用，但對色素的凈化能力不理想。對于色素含量大的韭菜樣品，如果不能在凈化過程中去除干凈，將會造成嚴重的基質(zhì)干擾。GCB凈化色素的能力較好，但由于其表面的六元環(huán)結構會吸附一些平面及對稱結構的農(nóng)藥，導致這些組分的回收率差，因此需要根據(jù)樣品色素含量對GCB的用量進行優(yōu)化，使其既能起到凈化作用，又不降低農(nóng)藥的回收率。C18具有強疏水性，對于樣品中的色素和脂類等非極性雜質(zhì)有吸附作用。凈化步驟中使用無水硫酸鎂除掉有機提取液中多余水分，從而保護儀器[1,19-20]。通過查閱相關文獻資料，試驗選擇韭菜陰性樣品進行加標回收率比較，加標量為50 μg/kg，分別考察4組凈化劑（配比見表2）對22種目標農(nóng)藥回收率的影響，結果見圖1。

表2 凈化條件

從圖1可以看出，在4種凈化條件下，22種農(nóng)藥的平均回收率（即b值）均大于81%。根據(jù)試驗觀察，C18和GCB可顯著降低韭菜乙腈提取液顏色深度，較澄清透明，平均回收率均高于未添加的第1組。在4種凈化條件下，回收率60%~120%的農(nóng)藥個數(shù)占總數(shù)（即a值）的50%~100%，其中，第4組最高，為100%，且其平均回收率為94.2%，明顯優(yōu)于另外3種方法，整體萃取效率高，因此，從節(jié)約成本、提高凈化效果綜合考慮，采用第4組作為最佳凈化條件。

圖1 4種不同凈化條件的對比

2.4 基質(zhì)效應的考察

氣相色譜-質(zhì)譜的基質(zhì)效應主要來自氣相色譜，以基質(zhì)增強效應為主，通常采用加入同位素內(nèi)標、配制基質(zhì)匹配標準曲線的方法減小其對定性定量分析的影響[16,21]。但因同位素內(nèi)標價格昂貴、同位素標記物種類有限、方法涉及農(nóng)藥品種較多，所以試驗采用比對溶劑配標準溶液和基質(zhì)匹配標準溶液的信號差異的方法來考察基質(zhì)效應。對每種目標化合物，用50 μg/L的基質(zhì)匹配標準溶液與相同濃度溶劑配制標準溶液的峰面積比例差異考察基質(zhì)效應，結果見表3。

表3 22種農(nóng)藥在基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應

由表3可知，基質(zhì)效應對22種農(nóng)藥的響應信號既有抑制作用也有增強作用，其中17種農(nóng)藥有基質(zhì)增強效應，只有滅多威、敵敵畏、3-羥基克百威、α-硫丹和β-硫丹5種農(nóng)藥表現(xiàn)出基質(zhì)抑制作用。因此，采用基質(zhì)匹配標準溶液作校準曲線來消除基質(zhì)效應。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性范圍及檢出限

采用韭菜空白基質(zhì)提取液作為標準溶液的稀釋液，繪制22種農(nóng)藥的基質(zhì)基質(zhì)混合標準工作曲線，在已優(yōu)化好的儀器條件下進行測定，在MRM模式下采集的22種農(nóng)藥標準溶液總離子流圖見圖2。以目標化合物濃度（X）為橫坐標，定量離子峰面積（Y）為縱坐標建立標準曲線，以10倍信噪比（S/N）計算定量限（LOQ），如表4所示。結果表明，22種農(nóng)藥在5~100 μg/L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關系，相關系數(shù)（R2）在0.995 73~0.999 91之間。根據(jù)GB 2763—2019[22]的規(guī)定，韭菜中各種農(nóng)藥殘留的限量均不低于10 μg/kg，22種農(nóng)藥的定量限均在10 μg/kg范圍內(nèi)，滿足相關食品安全國家標準中對韭菜中農(nóng)藥殘留限量及分析方法的要求。

圖2 22種農(nóng)藥混合標準溶液在MRM模式下總離子流色譜圖

表4 22種農(nóng)藥的線性方程、相關系數(shù)和定量限

2.5.2 加標樣品的回收率和精密度

在韭菜陰性樣品中，添加0.01，0.04和0.07 mg/kg這3個水平的混合標準溶液，同時制備平行樣品，按照1.3進行樣品前處理和測定后進行加標回收率和精密度計算，結果見表5。22種農(nóng)藥在3個加標水平下的平均回收率為61.3%~115.8%，相對標準偏差（SRSD）為1.5%~9.4%，說明試驗方法準確可靠。

表5 樣品中3個水平加標下22種農(nóng)藥的回收率（n=3）和精密度（n=7）

2.5.3 實際樣品的測定

應用試驗所建立的方法對市售的60份韭菜樣品進行檢測，共檢出農(nóng)藥殘留7種，其中，8份樣品檢出氯氟氰菊酯，質(zhì)量分數(shù)范圍為0.020~1.20 mg/kg；5份樣品檢出毒死蜱，質(zhì)量分數(shù)范圍為0.024~0.21 mg/kg；2份樣品檢出敵敵畏，質(zhì)量分數(shù)分別為0.014和0.030 mg/kg；2份樣品檢出克百威，質(zhì)量分數(shù)分別為0.012和0.013 mg/kg；1份樣品檢出水胺硫磷，質(zhì)量分數(shù)為0.28 mg/kg；1份樣品檢出樂果，質(zhì)量分數(shù)為0.036 mg/kg；1份樣品檢出滅多威，質(zhì)量分數(shù)為0.013 mg/kg。其余樣品均未檢出上述22種農(nóng)藥殘留。

3 結論

試驗建立氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）同時測定韭菜中22種農(nóng)藥殘留的方法。韭菜勻漿經(jīng)乙腈提取，以QuEChERS法為前處理技術，優(yōu)化MgSO4、PSA、GCB用量，在質(zhì)譜MRM模式下檢測，基質(zhì)內(nèi)標法定量。結果表明，22種農(nóng)藥在5~100 μg/L的范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.995 73~0.999 91，加標回收率在61.3%~115.8%之間，相對標準偏差小于10%，定量限為0.003~0.01 mg/kg。該方法具有前處理溶劑用量少、操作簡單、重復性好、效率高等特點，易于批量操作，且GC-MS/MS在定性定量方面具有優(yōu)勢，能夠有效地避免雜質(zhì)的干擾，同時篩查多種農(nóng)藥殘留，降低分析成本。通過韭菜陰性樣品加標，方法獲得較高回收率，滿足日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作，且成功用于實際樣品分析，表明試驗方法準確可靠，適用于韭菜中多種農(nóng)藥的同時快速測定。