葉文峰，王紫薇，于苗苗，關(guān)愛(ài)國(guó)

1. 宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院（宜春 336000）；2. 江西科技職業(yè)學(xué)院（南昌 330200）

黃精是一種藥食同源的滋補(bǔ)佳品，主要有降低血糖和血脂、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎抗菌等作用[1-3]，常用于功能食品的開(kāi)發(fā)。我國(guó)黃精資源豐富，目前對(duì)黃精的研究多以黃精化學(xué)成分、藥理作用及黃精多糖功效等為主，對(duì)黃精深加工工藝的研究還處于起步階段[4]。目前，市場(chǎng)上已出現(xiàn)膠囊、糖漿、茶、面膜等產(chǎn)品，如“可溶性黃精紅景天功能食品”[5]，但關(guān)于黃精利用乳酸菌發(fā)酵的飲料這方面的研究還比較少[6]。服用生黃精時(shí)，口腔有麻味，對(duì)咽喉有刺激[7]，處理不當(dāng)無(wú)法最大程度發(fā)揮其功效。根據(jù)現(xiàn)有研究，目前處理黃精的方法主要有干燥法、煮制法、蒸制法，但這些加工方法會(huì)使黃精中水溶性成分流失，損失較大[8]。而與傳統(tǒng)加工法相比，發(fā)酵法對(duì)提高黃精抗氧化能力及降低刺激性更為突出，且能最大限度地保留黃精中的有效成分[9]。

黃精化學(xué)成分中含量最多的是糖類(lèi)物質(zhì)，其中淀粉含量為25.1%[10]，糖化酶可以將淀粉分解為還原糖，利于乳酸菌吸收利用[11]，促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，提高發(fā)酵產(chǎn)物的積累。發(fā)酵起到破壁作用，促進(jìn)活性物質(zhì)溶出[12]。黃精發(fā)酵后可降低食用黃精后口腔的麻感，減輕對(duì)咽喉的刺激，同時(shí)使代謝產(chǎn)物之間相互協(xié)調(diào)，可改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。試驗(yàn)以鮮黃精為原料，優(yōu)化糖化工藝和發(fā)酵工藝，為黃精發(fā)酵飲料的開(kāi)發(fā)提供參考[13]。

1 材料、試劑及設(shè)備

1.1 材料與試劑

黃精（新鮮飽滿(mǎn)、棕黃色、無(wú)損壞）；保加利亞乳桿菌（校生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)）；糖化酶（20萬(wàn) U/g）；脫脂乳粉、瓊脂、檸檬酸（食品級(jí)，符合國(guó)家國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)）；3, 5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、無(wú)水葡萄糖（均為分析純）；MRS培養(yǎng)基（保加利亞乳桿菌培養(yǎng)）。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-752N，上海佑科儀器儀表有限公司）；數(shù)電熱恒溫干燥箱（202-A型，上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（寧波久興醫(yī)療器械有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃精糖化試驗(yàn)

2.1.1 還原糖測(cè)定

2.1.1.1 還原糖測(cè)定方法

3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)還原糖是一種準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的方法[14]，經(jīng)常被人們使用。還原糖含量計(jì)算公式：還原糖=查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)/樣品毫克數(shù)×100%[15]。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的繪制

無(wú)水葡萄糖烘干（105 ℃）至恒重，準(zhǔn)確稱(chēng)取133.0 mg，溶解，定容至100 mL，即得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，質(zhì)量濃度為1.33 g/L。

準(zhǔn)確量取0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于6個(gè)20 mL具塞試管中，補(bǔ)入蒸餾水至1 mL，加入2 mL DNS試液，搖勻后置沸水中保溫5 min，取出后用流水冷卻至室溫，加蒸餾水至10 mL，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)液。以0號(hào)試管為對(duì)照，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度?？v坐標(biāo)表示吸光度，橫坐標(biāo)表示葡萄糖質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=15.147X-0.130 6（r=0.999 6），其在0.068~0.876 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[16]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1.3 樣品中還原糖含量的測(cè)定

以糖化液為樣品，參照2.1.1.2中的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.1.2 黃精糖化工藝

黃精清洗去皮→打漿→糊化→調(diào)節(jié)pH→糖化→黃精糖化液→測(cè)定糖化液還原糖含量 糖化酶↗

2.1.3 單因素試驗(yàn)

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)可知料液比、糖化時(shí)間、糖化酶添加量對(duì)糖化工藝的影響較大，故選擇這3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.1.3.1 料液比對(duì)黃精糖化試驗(yàn)的影響

將黃精按照不同的料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）進(jìn)行打漿，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4，加入2%的糖化酶，在60 ℃的水浴鍋中放置3 h，糖化完成后煮沸滅酶。依照標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖測(cè)定方法測(cè)定不同料液比時(shí)黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.3.2 糖化時(shí)間對(duì)黃精糖化試驗(yàn)的影響

黃精以料液比1∶30（g/mL）打漿，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4，在水浴鍋中加熱至60 ℃，加入2%的糖化酶，設(shè)定糖化時(shí)間2，3，4，5和6 h，糖化完成后煮沸使酶喪失活性。按照標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的方法測(cè)定不同糖化時(shí)間下黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.3.3 糖化酶添加量對(duì)黃精糖化試驗(yàn)的影響

取黃精以料液比1∶30（g/mL）打漿，檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4，加入1%，1.5%，2%，2.5%和3%的糖化酶，在60 ℃的水浴鍋中糖化3 h，糖化完成，測(cè)定不同酶添加量下黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.4 黃精糖化工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取每個(gè)因素的水平范圍，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1，確定黃精糖化最優(yōu)條件。

表1 黃精糖化正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 黃精發(fā)酵液發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 菌種的活化[17]

選用保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵劑制備的菌種，將生理鹽水和保加利亞乳桿菌凍干粉的混合溶液接種在MRS固體培養(yǎng)基中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到菌苔布滿(mǎn)1/2以上培養(yǎng)皿為止。配制10%脫脂乳，與其他儀器一起在高壓蒸汽滅菌鍋中殺菌，放入超凈工作臺(tái)中冷卻。用接種環(huán)挑取MRS培養(yǎng)基上的乳酸桿菌，將其接種到滅菌脫脂乳中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝乳，然后再將錐形瓶中菌種接種于10%脫脂乳中培養(yǎng)。經(jīng)3~5次活化，最后凝固時(shí)間在5 h內(nèi)認(rèn)為是活化完成。

2.2.2 菌種的馴化[18-19]

為了使乳酸菌能夠在黃精糖化液中更好地生長(zhǎng)，必須對(duì)菌種進(jìn)行馴化。馴化方法參照文獻(xiàn)[18]中的方法，活化后的菌種以3%的接種量接種于不同比例混合的黃精糖化液和脫脂乳培養(yǎng)基中。逐漸增加黃精糖化液的比例，馴化3~5次，直到乳酸菌能在低含量脫脂乳粉存在的黃精糖化液中正常生長(zhǎng)，馴化后的菌種放入0~4 ℃的冰箱中保存。

2.2.3 黃精發(fā)酵單因素試驗(yàn)

經(jīng)查閱資料了解到發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵劑添加量及奶粉添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響比較明顯，故選這三個(gè)因素做單因素試驗(yàn)。

2.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃精糖化液發(fā)酵試驗(yàn)的影響

各取30 mL黃精糖化液置于5個(gè)錐形瓶中，加入0.2%的脫脂乳粉后搖勻，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15 min，取出放入超凈工作臺(tái)中冷卻，接入5%的菌種，搖勻，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)10，12，14，16和18 h，取出放入0~4 ℃的冰箱中保存，以待后續(xù)感官評(píng)價(jià)。

2.2.3.2 發(fā)酵劑添加量對(duì)黃精糖化液發(fā)酵試驗(yàn)的影響

取5個(gè)錐形瓶，各加入30 mL黃精糖化液，加入0.2%的脫脂乳粉，搖勻，滅菌，冷卻，各接種3%，4%，5%，6%和7%的發(fā)酵劑，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后取出，存放于0~4 ℃的冰箱中備用。

2.2.3.3 脫脂乳粉添加量對(duì)黃精糖化液發(fā)酵試驗(yàn)的影響

取5個(gè)錐形瓶，各加入30 mL黃精糖化液，再依次加入0，0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的脫脂乳粉，搖勻后滅菌，取出放入超凈工作臺(tái)冷卻，接種5%的發(fā)酵劑，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后取出，放于0~4 ℃的冰箱中備用。

2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化黃精發(fā)酵液工藝條件

以響應(yīng)值為感官評(píng)分，在發(fā)酵單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間、脫脂奶粉添加量和發(fā)酵劑添加量為考察因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化黃精發(fā)酵的因素與水平

2.2.5 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

選擇20名無(wú)特殊口味偏好的食品專(zhuān)業(yè)學(xué)生對(duì)黃精發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)定，滿(mǎn)分為100分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[13]，詳見(jiàn)表3。

表3 黃精發(fā)酵液感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3 試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 黃精糖化工藝結(jié)果分析

3.1.1 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖2可知，隨著黃精中加水量的增加，還原糖含量先增加后減少，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)還原糖含量最高。黃精漿中加水量低，黃精漿過(guò)于黏稠，溶出的可利用物過(guò)少，不利于糖化；加水量過(guò)多，原料過(guò)度稀釋?zhuān)膊焕谔腔９蔬x取料液比1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）為三水平做優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)糖化試驗(yàn)的影響

3.1.2 糖化酶添加量單因素試驗(yàn)

由圖3可知，糖化酶添加量在2%時(shí)，糖化液的還原糖含量最高。隨著糖化酶添加量增加，還原糖含量變化不明顯，這是由于一定量底物存在與之相適應(yīng)的最大酶用量，若存在過(guò)多的酶，則無(wú)法與底物結(jié)合，不能提高還原糖含量。故選擇酶添加量1.5%，2%和2.5%為三水平做優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 糖化酶添加量對(duì)糖化試驗(yàn)的影響

3.1.3 糖化時(shí)間單因素試驗(yàn)

由圖4可以看出，還原糖含量隨著糖化時(shí)間的增加而不斷增加，到4 h時(shí)達(dá)到最大，之后趨于穩(wěn)定，這是由于一定量黃精中的可利用物質(zhì)完全與糖化酶的活性中心結(jié)合需要一定的時(shí)間，底物與酶完全結(jié)合后產(chǎn)物的量趨于穩(wěn)定。故選取3，4和5 h為三水平做優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 糖化時(shí)間對(duì)糖化試驗(yàn)的影響

3.1.4 糖化工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

由表4可以看出，黃精糖化最佳工藝為A3B2C3，即料液比1∶40（g/mL），糖化酶添加量2%，糖化時(shí)間5 h。由極差分析得到影響因素C＞B＞A，糖化時(shí)間顯著性最高，其次是糖化酶添加量，顯著性最低的是料液比。為了進(jìn)一步確定試驗(yàn)結(jié)果，按照最優(yōu)條件進(jìn)行黃精糖化驗(yàn)證試驗(yàn)，糖化液中還原糖含量為22.46%，正交優(yōu)化結(jié)果可信。所以，黃精糖化試驗(yàn)最佳條件為料液比1∶40（g/mL）、糖化酶添加量2%、糖化時(shí)間5 h。

表4 黃精糖化工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

3.2 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖5可以看出，發(fā)酵時(shí)間從10 h到14 h，感官評(píng)分逐漸上升，到14 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，隨后又逐漸降低。這是因?yàn)殚_(kāi)始階段乳桿菌細(xì)胞數(shù)不足，無(wú)法充分利用培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)形成較少，氣味寡淡，殘?jiān)^多，顏色透亮度低；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，14 h時(shí)發(fā)酵液各方面均達(dá)到最優(yōu)，這時(shí)發(fā)酵時(shí)間再延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，次生代謝產(chǎn)物積累會(huì)不利于菌體生長(zhǎng)[20]，甚至出現(xiàn)酸甜不協(xié)調(diào)的情況，因此選定12，14和16 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三水平。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

3.2.2 發(fā)酵劑添加量的確定

由圖6可知，感官評(píng)分隨著發(fā)酵劑添加量的增加出現(xiàn)先增大后降低的變化情況，在4%時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大。這是由于接種量不足，菌體生長(zhǎng)達(dá)到高峰時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基利用率低，產(chǎn)物合成滯后，接種量過(guò)大會(huì)使菌體生長(zhǎng)加快，培養(yǎng)基黏度增加，影響產(chǎn)物合成，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。故選取3%，4%和5%為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三水平。

圖6 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵試驗(yàn)的影響

3.2.3 奶粉添加量的確定

奶粉可以提供氮源和少量乳糖，適當(dāng)?shù)奶砑恿靠梢蕴岣甙l(fā)酵液品質(zhì)。由圖7可知，感官評(píng)分隨著奶粉添加量的增加而上升，在添加量0.2%時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大，之后隨著奶粉添加量的增加，感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)。過(guò)低的奶粉添加量不足維持乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，過(guò)多的奶粉添加量會(huì)使發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)度，產(chǎn)酸過(guò)量，產(chǎn)生不良?xì)馕?。選擇0.1%，0.2%和0.3%為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

圖7 奶粉添加量對(duì)發(fā)酵試驗(yàn)的影響

3.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化黃精發(fā)酵工藝

根據(jù)發(fā)酵試驗(yàn)單因素結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間、脫脂奶粉添加量和發(fā)酵劑添加量為影響因素，以黃精發(fā)酵液的感官評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表5，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程：

感官評(píng)分=+81.20-2.75A-0.50B-4.00C-2.75AB-1.25AC+2.75BC-1.47A2-4.47B2-3.48C2

由表6可知，該模型方程p＜0.01，有極顯著性影響，失擬項(xiàng)p=0.070 6＞0.05，無(wú)顯著性，說(shuō)明無(wú)失擬因素存在。由F檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)中發(fā)酵時(shí)間（A）和脫脂奶粉添加量（C）的p＜0.01，表明這兩個(gè)因素對(duì)黃精發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有十分顯著影響；交互項(xiàng)中發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵劑添加量（AB）、發(fā)酵劑添加量與脫脂乳粉添加量（BC）之間的交互項(xiàng)p＜0.05，說(shuō)明這兩組交互項(xiàng)對(duì)黃精發(fā)酵工藝的感官優(yōu)化有顯著影響；在二次項(xiàng)中，發(fā)酵劑接種量的p＜0.01，表明發(fā)酵劑添加量對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝有極顯著影響，脫脂奶粉添加量的p＜0.05，表明其對(duì)黃精發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有顯著影響；其他因素p＞0.05，影響不顯著。

表6 回歸模型方差分析

3.2.5 響應(yīng)面與等高線結(jié)果分析

當(dāng)固定兩個(gè)因素時(shí)，黃精發(fā)酵液的感官評(píng)分隨著第三個(gè)因素的增加呈現(xiàn)先變大后變小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為最優(yōu)因素條件，響應(yīng)面的陡峭程度及等高線的形狀反映兩因素間交互作用的顯著性[22]。從圖8~圖10可以看出，發(fā)酵時(shí)間（A）與發(fā)酵劑量（B），發(fā)酵劑量（B）與奶粉添加量（C）這兩組交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響顯著，而發(fā)酵時(shí)間（A）與奶粉添加量（C）的曲面相對(duì)平緩且對(duì)應(yīng)等高線偏圓，說(shuō)明AC項(xiàng)交互作用對(duì)黃精發(fā)酵液感官評(píng)分影響較小。

圖8 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵劑添加量的響應(yīng)面及等高線分析圖

圖9 發(fā)酵時(shí)間與奶粉添加量的響應(yīng)面及等高線分析圖

圖10 發(fā)酵劑添加量與奶粉量的響應(yīng)面及等高線分析圖

3.2.6 黃精發(fā)酵最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

由響應(yīng)面軟件分析得最優(yōu)工藝條件：發(fā)酵時(shí)間

12.31 h、發(fā)酵劑添加量4.08%、奶粉添加量0.16%，此次感官評(píng)分為83.121 6分。為了便于試驗(yàn)操作，對(duì)各參數(shù)稍作調(diào)整：發(fā)酵時(shí)間12.5 h、發(fā)酵劑添加量4%、奶粉添加量0.2%。經(jīng)過(guò)3組驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分為83.6分，與理論預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明經(jīng)優(yōu)化該發(fā)酵工藝具有可行性。

4 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)黃精糖化工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳糖化工藝條件：料液比1∶40（g/mL）、糖化酶添加量2%、糖化時(shí)間5 h，按此工藝可得到還原糖含量為22.46%的糖化液，原料利用率得到提高。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)黃精發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵劑添加量4%、奶粉添加量0.2%、發(fā)酵時(shí)間12.5 h，按此工藝可得到組織均勻、澄清透亮、香味濃郁的黃精發(fā)酵液。