范祺，張明，張博華，楊立風(fēng)，王崇隊(duì)，馬超*

中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院（濟(jì)南 250014）

蘋果渣是新鮮蘋果經(jīng)破碎壓榨提汁后的剩余物，主要由果皮、果核和殘余果肉組成，含有可溶性糖、維生素、礦物質(zhì)及纖維素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是良好的飼料資源[1]。隨著農(nóng)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)和蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展觀點(diǎn)的提出，近年來從蘋果果汁廢棄物和蘋果工業(yè)廢棄物中提取蘋果多酚成為研究重點(diǎn)，蘋果多酚具有很強(qiáng)的抗氧化作用，且其抗氧化活性因蘋果的成熟度、品種和生長環(huán)境等因素的不同而有所區(qū)別[2]。目前從蘋果中提取多酚研究比較廣泛，但是對于蘋果渣的開發(fā)利用研究較少。因此針對蘋果渣多酚的開發(fā)利用，對于實(shí)現(xiàn)廢棄物的再利用和環(huán)境保護(hù)都有重要的意義。

當(dāng)代食品功能因子的開發(fā)與利用多結(jié)合新型技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高效提取，其中超聲波、微波具有設(shè)備簡單、適用范圍廣、提取效率高、省時(shí)、節(jié)省試劑等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取研究[3-5]。但是一種技術(shù)的獨(dú)立應(yīng)用，對活性成分提取得率的提升有限，需要將幾種提取方式聯(lián)合起來，才能充分發(fā)揮幾種技術(shù)的優(yōu)勢[6]。這幾年蒸汽爆破技術(shù)在食品行業(yè)的應(yīng)用越來越廣泛，在活性成分的提取方面的應(yīng)用也越來越多[7]。

蒸汽爆破即汽爆（steam explosion），是應(yīng)用蒸汽彈射原理實(shí)現(xiàn)爆炸過程對生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理的一種技術(shù)。蒸汽爆破是將物料置于高壓密閉環(huán)境中，利用過熱蒸汽將物料加熱到較高的溫度，在一定壓力下保持?jǐn)?shù)秒或數(shù)分鐘后瞬間泄壓，隨著壓力驟降、水分汽化，物料產(chǎn)生爆破效應(yīng)的一種物理處理方法[8]。植物細(xì)胞中的纖維為木素所粘結(jié)，與高溫、高壓蒸汽作用下，纖維素結(jié)晶度提高，聚合度下降，半纖維素部分降解，木素軟化，橫向連結(jié)強(qiáng)度下降，甚至軟化可塑[9]。當(dāng)充滿壓力蒸汽的物料驟然減壓時(shí)，孔隙中急劇膨脹，產(chǎn)生“爆破”效果，可部分剝離木素，使其通透性變強(qiáng)，更利于多酚黃酮類活性物質(zhì)的提取。

以蒸汽爆破為前處理技術(shù)，聯(lián)合微波和超聲等提取技術(shù)，優(yōu)化蒸汽爆破提取多酚的條件，聯(lián)合3種提取技術(shù)，獲得多酚提取率的最大值，并研究3種提取技術(shù)對蘋果渣多酚抗氧化活性的影響，為蘋果渣廢物的重新利用、減少環(huán)境污染提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣（煙臺安德利有限公司）；福林酚、沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、DPPH（上海麥克林有限公司）；甲醇、無水乙醇、硫酸鐵、水楊（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SHA-B型恒溫水浴搖床（江蘇杰瑞爾電器有限公司）；QBS-80型蒸汽爆破設(shè)備（鶴壁政道啟寶實(shí)業(yè)有限公司）；Vortex-3型旋渦混合儀（上海嘉鵬科技有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WZD4S-01微波真空設(shè)備（南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司）；SB-1100型水浴鍋、N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；UV1000型單光束紫外/可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

選取一定量的蘋果渣，按照一定比例添加去離子水，充分混合，放置過夜，待用。

1.3.2 蘋果渣多酚提取工藝流程蘋果渣→預(yù)處理→汽爆處理→烘干打粉→多酚提取→提取方式優(yōu)化→離心濃縮→多酚提取液

1.3.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用Folin-Ciocalteus法[10]，回歸方程為y=0.040 9x+

0.054 3，R2=0.999 6。

1.3.4 提取溶劑對蘋果渣多酚得率的影響

分別以純水、50%乙醇、乙醇、50%甲醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯作為提取溶劑，料液比為1∶30（g/mL），靜置30 min，離心處理（3 000 r/min，5 min），過濾上清液，定容至50 mL，即得不同溶劑提取液。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 復(fù)水率對蘋果渣多酚提取率的影響

設(shè)定復(fù)水率30%，50%，70%和90%，汽爆穩(wěn)壓時(shí)間90 s，汽爆壓力0.9 MPa，對蘋果渣進(jìn)行預(yù)處理，收集汽爆后的樣品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，經(jīng)離心、過濾、濃縮，得到蘋果渣提取物。

1.3.5.2 蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間對蘋果渣多酚提取率的影響

設(shè)定蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間30，60，90，120，150和180 s，汽爆壓力0.9 MPa，對蘋果渣進(jìn)行預(yù)處理，收集汽爆后的樣品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，經(jīng)離心、過濾、濃縮，得到蘋果渣提取物。

1.3.5.3 蒸汽爆破壓力對蘋果渣多酚提取率的影響

設(shè)置蒸汽爆破壓力0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 MPa，穩(wěn)壓時(shí)間90 s，對蘋果渣進(jìn)行預(yù)處理，收集汽爆后的樣品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，經(jīng)離心、過濾、濃縮，得到蘋果渣提取物。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取復(fù)水率、蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間、蒸汽爆破壓力3個(gè)因素，并取3個(gè)水平（如表1所示），以蘋果渣多酚得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 提取方式的優(yōu)化

1.3.7.1 微波優(yōu)化蘋果渣多酚的提取

采用微波輔助提取法，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率800 W的條件下，選擇微波處理30，60，90，120和150 s，冷卻至室溫，經(jīng)離心、過濾、濃縮，得到蘋果渣提取物。利用1.3.3的方法測定多酚得率，并與汽爆處理后的樣品的得率進(jìn)行比較。

1.3.7.2 超聲優(yōu)化蘋果渣多酚的提取

采用超聲輔助提取法，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率800 W的條件下，選擇超聲處理2，4，6，8和10 min，冷卻至室溫，經(jīng)離心、過濾、濃縮，得到蘋果渣提取物。利用1.3.3的方法測定多酚得率，并與汽爆處理后的樣品的得率進(jìn)行比較。

1.3.8 蘋果渣多酚對DPPH自由基清除作用[11]

取2 mL蘋果渣提取液，加入2 mL 400 μmol/L DPPH溶液，于30 ℃暗室反應(yīng)30 min，以2 mL甲醇作為空白對照，在517 nm處測定其吸光度，計(jì)算DPPH自由基清除率以及IC50值。

1.3.9 蘋果渣多酚對羥自由基清除能力[12]

量取2 mL 1.8 mmol/L的FeSO4放入試管中，加入1.5 mL 1.8 mmol/L水楊酸和1 mL不同濃度樣品溶液，最后加入0.1 mL 0.03% H2O2并啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)30 min，然后2 000 r/min離心10 min，以蒸餾水代替樣品溶液做空白參比，在510 nm處測定吸光度。

1.3.10 蘋果渣多酚還原力測定[13]

取不同量待測液加去離子水補(bǔ)足至1 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的鐵氰化鉀溶液各2 mL，混合均勻，于50 ℃保溫20 min，放至室溫，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均勻，靜置10 min。取2 mL混合液，加2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混合均勻，放置10 min，在700 nm下測定吸光度。同時(shí)以去離子水代替樣品做空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。方差分析使用SPSS 23.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑對多酚得率的影響

由圖1可知，不同溶劑的提取得率具有較大差異，其中50%乙醇、50%甲醇和甲醇提取的多酚得率較高，分別為0.24%，0.20%和0.18%，純水提取的得率最低，為0.12%，乙酸乙酯與正丁醇提取的得率接近。提取得率順序?yàn)?0%乙醇＞50%甲醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞正丁醇＞乙醇＞純水，其原因可能是醇水混合提取液更有利于提取水溶性和醇溶性的多酚物質(zhì)[14]，故選擇50%乙醇為蘋果渣多酚提取的最優(yōu)試劑。

圖1 提取溶劑對蘋果渣多酚得率的影響

2.2 蒸汽爆破壓力對多酚得率的影響

由圖2可知，隨著汽爆壓力的增大，蘋果渣多酚含量含量呈現(xiàn)出上升趨勢，當(dāng)蒸汽爆破壓力為0.3 MPa時(shí)，得率為0.18%；當(dāng)壓力為0.6 MPa時(shí)，得率為0.22%；當(dāng)壓力為0.9 MPa時(shí)，蘋果渣多酚的得率有了較大提升，為0.4%。但是當(dāng)壓力超過0.9 MPa后，繼續(xù)增加壓力對多酚得率的提升影響不明顯。選擇合適的汽爆壓力能獲得最高的多酚提取率，主要原因是蒸汽爆破處理使蘋果渣緊密的纖維結(jié)構(gòu)解聚，提取液更容易滲透進(jìn)果皮內(nèi)部，增加了果渣與提取溶劑接觸面積，最終使更多的多酚溶解在提取液中，進(jìn)而提高多酚的得率[15]。

圖2 汽爆壓力對蘋果渣多酚得率的影響

2.3 蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間對多酚得率的影響

由圖3可以看出，隨著汽爆穩(wěn)壓時(shí)間的延長，蘋果渣多酚的含量呈現(xiàn)增大的趨勢，當(dāng)蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間為30 s時(shí)，多酚得率變化不明顯。當(dāng)穩(wěn)壓時(shí)間為60 s時(shí)，多酚得率由0.21%增長到0.338%。當(dāng)穩(wěn)壓時(shí)間為90 s時(shí)，多酚得率進(jìn)一步提升，為0.43%。穩(wěn)壓時(shí)間進(jìn)一步增加，多酚得率變化不明顯。蒸汽爆破的工作原理是將原料置于高溫、高壓環(huán)境中，原料被過熱液體潤脹，蒸汽充滿孔隙，穩(wěn)壓時(shí)間越長，越利于過熱蒸汽充滿物料內(nèi)部，原料孔隙中的過熱液體迅速汽化，體積瞬間膨脹導(dǎo)致細(xì)胞“爆破”。當(dāng)穩(wěn)壓時(shí)間在90 s以后，內(nèi)部蒸汽已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[16]。但是隨著時(shí)間的延長，蘋果渣碳化變黑比較嚴(yán)重，且能源消耗比較嚴(yán)重，因此汽爆時(shí)間選擇在90 s比較合適。

圖3 汽爆穩(wěn)壓時(shí)間對蘋果渣多酚得率的影響

2.4 復(fù)水率對多酚得率的影響

由圖4可以看出，當(dāng)蘋果渣未加純水調(diào)節(jié)復(fù)水率時(shí)，經(jīng)汽爆處理，多酚得率為0.37%；當(dāng)復(fù)水率為30%時(shí)，多酚得率略有提升，為0.41%。繼續(xù)提高復(fù)水率，多酚得率變化不大。當(dāng)復(fù)水率為90%時(shí)，多酚得率降低到0.34%。在蒸汽爆破之前添加一定量的純水，調(diào)節(jié)樣品的復(fù)水率，水分滲透進(jìn)樣品中，當(dāng)汽爆處理時(shí)，樣品能夠充分膨脹，將內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)破壞得更充分，更有利于活性成分的溶出，但是水含量過高，汽爆過程中產(chǎn)生的高溫會(huì)對活性成分產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致活性和提取得率降低[17]。當(dāng)復(fù)水率為70%時(shí)，汽爆后的樣品呈現(xiàn)漿糊狀，不利于收集和保存，因此建議復(fù)水率50%最合適。

圖4 復(fù)水率對蘋果渣多酚得率的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2的極差分析可知，試驗(yàn)因素對蘋果渣多酚含量影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A，即蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間＞復(fù)水率＞蒸汽爆破壓力。由k值大小可知，優(yōu)化組合為A3B3C1，即蒸汽爆破壓力1.0 MPa，蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間100 s，復(fù)水率30%。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下蘋果渣多酚得率為0.43%，比汽爆前蘋果渣多酚得率提高115%。

表2 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

2.6 微波處理對蘋果渣多酚得率的影響

微波時(shí)間在30~120 s之間，蘋果渣多酚得率與提取時(shí)間呈正相關(guān)，隨著微波時(shí)間的增加，微波破壞蘋果渣細(xì)胞壁的效果顯著，從而使蘋果渣多酚的提取得率呈上升趨勢。微波時(shí)間在120 s時(shí)，蘋果渣多酚提取量達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加微波時(shí)間，多酚提取量與微波時(shí)間呈反比。提取時(shí)間過短，多酚提取不完全；提取時(shí)間過長，不僅會(huì)增加能耗，而且多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性會(huì)變差，從而降低多酚得率[18]。因此，微波處理時(shí)間建議維持在120 s。

2.7 超聲處理對蘋果渣多酚得率的影響

蘋果渣經(jīng)超聲處理2，4，6和8 min，多酚得率分別為0.21%，0.29%，0.38%和0.55%，處理時(shí)間在8 min內(nèi)，蘋果渣多酚的得率隨著處理時(shí)間的延長而增加。借助超聲波產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”，可以加速多酚的滲透速度[19]。當(dāng)時(shí)間延長至10 min時(shí)，多酚的得率略有下降，為0.50%。推測是超聲波長時(shí)間作用使部分多酚分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚提取率降低[20]。與圖5相比，超聲對多酚得率的改善強(qiáng)于微波的改善作用。

圖5 微波時(shí)間對蘋果渣多酚得率的影響

圖6 超聲時(shí)間對蘋果渣多酚得率的影響

2.8 幾種方式聯(lián)合對蘋果渣多酚得率的影響

當(dāng)幾種提取方式聯(lián)合后，蘋果渣多酚的得率有明顯的提升。未經(jīng)處理的樣品，經(jīng)提取以后，多酚得率僅為0.2%，而經(jīng)過汽爆處理，多酚得率為0.41%，是未經(jīng)處理的2倍。經(jīng)汽爆處理的樣品多酚得率略低于超聲與微波聯(lián)合處理后的多酚得率0.46%。經(jīng)汽爆處理，再分別進(jìn)行微波和超聲處理，多酚得率分別為0.58%和0.66%，說明超聲對多酚的提取改善作用更強(qiáng)，這可能是因?yàn)槌曁幚磉^程中溫度變化不大，導(dǎo)致多酚的活性損失較小，而微波處理則面臨高溫的破壞問題。經(jīng)過汽爆、微波、超聲三種方式聯(lián)合，獲得的最大多酚得率為0.81%。

圖7 不同預(yù)處理方式對蘋果渣多酚得率的影響

2.9 DPPH清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，遇甲醇溶液顯紫色，自由基清除劑能夠與DPPH的單電子配對，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度隨之變小，DPPH自由基清除率越高表明其抗氧化能力越大。蘋果渣多酚具有良好的DPPH清除率。半數(shù)清除率IC50反映被測樣品的抗氧化能力，數(shù)值越小，說明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖8可以看出，未經(jīng)汽爆、微波、超聲處理的樣品的半數(shù)清除率為196.9 μg/mL，經(jīng)過氣爆處理，半數(shù)清除率有明顯的降低，為137.4 μg/mL。汽爆分別聯(lián)合微波、超聲處理，半數(shù)清除率基本接近，并且進(jìn)一步降低，分別為100.11 μg/mL和98.32 μg/mL，當(dāng)三種技術(shù)聯(lián)合處理時(shí)，半數(shù)清除率下降至82.5 μg/mL。

圖8 不同預(yù)處理方式下的DPPH半數(shù)清除率

2.10 羥自由基清除率

蘋果渣多酚具有良好的羥自由基清除率。半數(shù)清除率IC50反映被測樣品的抗氧化能力，數(shù)值越小，樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖9可以看出，未經(jīng)汽爆、微波、超聲處理的樣品的半數(shù)清除率數(shù)值較大，為

圖9 不同預(yù)處理方式下的羥自由基半數(shù)清除率

723.9 μg/mL，經(jīng)過汽爆處理，半數(shù)清除率有明顯的降低，為565.8 μg/mL。汽爆分別聯(lián)合微波、超聲處理，半數(shù)清除率基本接近，并且進(jìn)一步降低，分別為442.1 μg/mL和459.8 μg/mL，當(dāng)三種技術(shù)聯(lián)合處理時(shí)，半數(shù)清除率有明顯的下降，為248 μg/mL，說明經(jīng)過汽爆、微波、超聲聯(lián)合處理，蘋果渣多酚的抗氧化能力有顯著的提升。

2.11 還原力測定

由圖10可知，樣品的總還原能力與樣品濃度具有劑量關(guān)系，斜率越大，還原能力越強(qiáng)。還原能力最強(qiáng)的為經(jīng)過氣爆、超聲和微波聯(lián)合處理得到的蘋果渣多酚，還原能力最弱的為空白組。微波+汽爆處理與微波+超聲所得的蘋果渣多酚的還原力接近，汽爆聯(lián)合超聲處理比只用汽爆處理所得的蘋果渣多酚的還原力強(qiáng)。

圖10 不同預(yù)處理方式下的還原力

3 結(jié)論

試驗(yàn)以蒸汽爆破預(yù)處理方式為研究對象，研究了不同溶劑對蘋果渣多酚得率的影響。不同溶劑的提取得率順序?yàn)?0%乙醇＞50%甲醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞正丁醇＞乙醇＞純水。試驗(yàn)還研究了汽爆參數(shù)復(fù)水率、汽爆穩(wěn)壓時(shí)間、汽爆壓力對蘋果渣多酚得率的影響。當(dāng)蒸汽爆破壓力高于0.9 MPa時(shí)，蘋果渣多酚的得率有較大提升。當(dāng)蒸汽爆破穩(wěn)壓時(shí)間為30 s時(shí)，多酚的得率變化不明顯。當(dāng)復(fù)水率為50%時(shí)，可獲得較大的蘋果渣多酚得率。

在研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)，得出蘋果渣多酚提取的最佳工藝：汽爆壓力1.0 MPa、汽爆時(shí)間100 s、復(fù)水率30%，此時(shí)蘋果渣多酚的提取得率最高，達(dá)到0.43%，比汽爆前蘋果渣多酚得率提高115%。與微波、超聲等其他預(yù)處理方式進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破所得的蘋果渣多酚的得率均高于這兩種處理方式。經(jīng)過汽爆、微波、超聲聯(lián)合處理，蘋果渣多酚的得率達(dá)到最高（0.81%）。并且蘋果渣多酚DPPH清除能力、羥自由基清除能力和還原力均有顯著提高?？傊羝萍夹g(shù)預(yù)處理為蘋果渣多酚廢物的重新利用提供了新思路，未來將擁有廣闊的應(yīng)用空間。