張 臣， 王艷麗， 黃中炎， 付曉榮， 王 勉， 張 麗， 汪曉婷△

［1武漢市武昌醫(yī)院（武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院）兒科，湖北武漢 430063；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）小兒呼吸二內(nèi)科，湖北武漢 430016］

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種革蘭氏陰性桿菌，通常存在于下消化道。在免疫防御受損或氣道清除機(jī)制受損的患者中，KP 可引起下呼吸道的嚴(yán)重感染［1］。目前，關(guān)于KP 誘導(dǎo)下呼吸道感染的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。最近的研究表明，KP 感染與Th1/Th17 CD4+T 細(xì)胞的存在有關(guān)［2］。此外，KP 感染患者的肺部、痰液和血液中白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）或IL-17A+CD4+T細(xì)胞水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［3］。然而，導(dǎo)致KP 相關(guān)感染的遺傳和環(huán)境因素仍不清楚。GTP 酶免疫相關(guān) 蛋 白5（GTPase of immunity-associated protein 5，GIMAP5）對淋巴細(xì)胞的存活至關(guān)重要，GIMAP5缺陷的CD4+T細(xì)胞在抗原刺激下表現(xiàn)出生存受損和DNA損傷增加［4］。在嚙齒類動物和人類受試者中，GIMAP5喪失功能突變會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，免疫耐受喪失，隨后出現(xiàn)自身免疫性疾?。?］。在GIMAP5缺陷小鼠中，表現(xiàn)為CD4+T 細(xì)胞驅(qū)動的結(jié)腸炎［6］。但目前尚不清楚KP感染是否通過調(diào)節(jié)GIMAP5的活性來控制T 細(xì)胞發(fā)育。因此，本項(xiàng)工作以大鼠CD4+T 細(xì)胞為研究對象，探討KP感染對細(xì)胞中GIMAP5表達(dá)、T細(xì)胞激活及Th17和Th1細(xì)胞體外發(fā)育的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

動物：從北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所獲得20 只Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠［SPF 級，200～250 g，3 月齡，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2017-0005］。動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，均可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。

菌株：KP 菌株購自中國科學(xué)院微生物研究所，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用生理鹽水稀釋為2.4×1011CFU/L，在動物體內(nèi)進(jìn)行KP誘導(dǎo)。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 使用CD4+T 細(xì)胞分離試劑盒（Miltenyi Biotech）從大鼠脾細(xì)胞中獲得CD4+T 細(xì)胞。將細(xì)胞接種在含10%熱滅活胎牛血清（Sigma-Aldrich）、55 μmol/L 2-巰基乙醇（Gibco）、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素（Sigma-Aldrich）的RPMI-1640 培養(yǎng)液（含L-谷氨酰胺；Gibco）中，加入抗CD3和抗CD28抗體（濃度分別為1和2 mg/L）進(jìn)行體外細(xì)胞刺激，觀察不同刺激時(shí)間（24、48 和72 h）對CD4+T細(xì)胞GIMAP5 表達(dá)的影響。為了誘導(dǎo)大鼠T 細(xì)胞亞群，在下列細(xì)胞因子和抗體的存在下激活細(xì)胞［4］：對于Th1細(xì)胞，使用20 μg/L IL-12和5 mg/L 抗大鼠IL-4抗體；對于Th17 細(xì)胞，使用0.5 μg/L 轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、50 μg/L IL-6、10 μg/L IL-23、10 μg/L IL-1β、5 mg/L 抗大鼠IFN-γ 抗體和5 mg/L 抗大鼠IL-4 抗體；對于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg），使用5 mg/L TGF-β?？贵w從BD Biosciences 購買，而細(xì)胞因子則從Miltenyi Biotech、Immunotools 或BioLegend 購買。對于CD4+T細(xì)胞活化和發(fā)育實(shí)驗(yàn)，將CD4+T 細(xì)胞分為對照（control、CTRL）組、KP 組和KP+GIMAP 組。除對照組外，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的KP 用PBS 稀釋至2.4×1011CFU/L，并按感染復(fù)數(shù)100∶1 的比例混合細(xì)菌與CD4+T 細(xì)胞共孵育6 h。此外，KP+GIMAP5 組加入GIMAP5重組蛋白（廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成）25 μmol/L，在37 ℃下預(yù)培養(yǎng)72 h。然后，各組加入抗CD3和抗CD28抗體（濃度分別為1和2 mg/L）體外刺激細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞，進(jìn)行以下測試。

2.2 Western blot檢查 收集培養(yǎng)細(xì)胞并在Laemmli樣品緩沖液中裂解，然后在95 ℃條件下加熱5 min。用BCA 蛋白定量分析試劑盒（Thermo Scientific）測量蛋白濃度。蛋白樣品在SDS-PAGE 上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用1∶1 000 稀釋的Ⅰ抗（GIMAP5 和GAPDH）和1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（均購自Cell Signaling Technology）檢測蛋白表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參照。

2.3 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 使用Purelink RNA Mini 試劑盒（Invitrogen）分離RNA。利用高容量cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems）將RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA，并在Applied Biosystems 7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR 檢測。mRNA 表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計(jì)算。GAPDH 的正向引物序列為5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′，反向引物序列為5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′；GIMAP5 的 正 向 引 物 序 列 為5′-TACCAGGAGCCCATTCACAAC-3′，反向引物序列為5′-GCCACAGGACATCAGCCAAGAA-3′。

2.4 流式細(xì)胞術(shù) 除了早期IL-2 生成的評估在激活后24 h 進(jìn)行外，其他所有的流式細(xì)胞術(shù)都是在激活后3 d 進(jìn)行的。所有流式抗體采用1∶200 稀釋。為了分析細(xì)胞增殖，細(xì)胞在激活前用CellTrackerTMViolet（CTV；Invitrogen）進(jìn)行預(yù)染色。用CTV 稀釋法評估細(xì)胞增殖水平。為了評估T 細(xì)胞的活化，收集洗滌細(xì)胞，并用抗大鼠CD44 和CD25 抗體染色。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：收集細(xì)胞并洗滌，用50 mg/L PMA+1 mg/L 離子霉素+10 mg/L 布雷菲爾德菌素A（均購自Sigma-Aldrich）重新刺激，4 h 后，沖洗細(xì)胞，用固定和滲透緩沖液（BioLegend）固定/滲透，并用抗大鼠IL-2、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-17A 染色。對于Treg 檢測，首先用抗大鼠CD25 抗體染色，然后用Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液組（Invitrogen）固定/滲透細(xì)胞，并用抗大鼠Foxp3 抗體孵育。所有樣本均在FACS Canto Ⅱ細(xì)胞分析儀（BD Biosciences）上處理。使用FlowJo軟件對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.5 RNA 測序與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 RNA 測序與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析由北京博奧生物有限公司完成?？俁NA使用Qubit 2.0（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行量化。采用獨(dú)創(chuàng)性路徑分析（Qiagen）進(jìn)行無偏路徑分析。只有計(jì)算出KP 處理組與Th0 對照組差異表達(dá)變化＞±1 倍且P＜0.05 的基因才被考慮用于通路分析。為了生成特定基因集的熱圖，使用了Morpheus 軟件（Broad Institute）?；蛄斜硎菑墓_可用的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）數(shù)據(jù)庫（Broad Institute）中獲得的，這些基因集的折疊改變基因表達(dá)在KP 處理的Th0 和對照Th0 RNAseq 數(shù)據(jù)中被量化。只有KP 處理組與對照組樣本差異表達(dá)變化＞±1倍且調(diào)整后P＜0.05的基因才被納入顯示原始讀取計(jì)數(shù)值的熱圖中。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用Student 雙尾檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析和Sidak多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CD3/CD28 刺激后CD4+T 細(xì)胞中GIMAP5 的表達(dá)上調(diào)

CD4+T 細(xì) 胞 受CD3/CD28 刺 激 后，GIMAP5 的mRNA 和蛋白水平與刺激前相比均顯著上調(diào)（P＜0.05），見 圖1A、B。此 外，CD3/CD28 刺 激 導(dǎo) 致GIMAP5在細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性積累，見圖1C。

Figure 1. CD3/CD28 activation induced the up-regulation of GIMAP5 expression in CD4+ T cells of rats. A：relative mRNA level of GIMAP5 in resting and activated CD4+T cells was detected by RT-qPCR；B：Western blot showed the expression and quantitative analysis of GIMAP5 protein in CD4+ T cells after activation；C：the protein expression of GIMAP5 in activated CD4+T cells was analyzed by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs resting group.圖1 CD3/CD28激活誘導(dǎo)大鼠CD4+T細(xì)胞GIMAP5表達(dá)上調(diào)

2 KP感染阻斷大鼠CD4+T細(xì)胞活化

為了測試KP 感染對T 細(xì)胞功能的影響，本研究用KP 感染CD4+T 細(xì)胞。結(jié)果顯示，在CD3/CD28 激活期間，用KP 處理大鼠CD4+T 細(xì)胞可降低活化T 細(xì)胞中GIMAP5 的水平，見圖2A。然后研究分析了KP感染對T 細(xì)胞功能的影響。在CD3/CD28 刺激后24 h，與對照組細(xì)胞相比，KP 感染組中產(chǎn)生IL-2 的細(xì)胞顯著減少（P＜0.01），加入GIMAP5 重組蛋白可恢復(fù)IL-2 的產(chǎn)生（P＜0.05），見圖2B。與這些結(jié)果一致，KP處理抑制大鼠CD4+T細(xì)胞的增殖（P＜0.01），加入GIMAP5 重組蛋白促進(jìn)了CD4+T 細(xì)胞增殖（P＜0.01），見圖2C、D。

Figure 2. KP infection blocked the CD4+ T cell activation in rats. A：Western blot was used to detect the protein expression of GIMAP5 in the CD4+T cells after KP treatment；B：the percentage of IL-2+cells after KP treatment was detected by flow cytometry；C：representative flow cytometry chart showing fluorescent CellTracer ?Violet to assess T cell proliferation；D：FlowJo software was used to calculate the division index to quantify T cell proliferation. Measn±SD. n=6.**P＜0.01 vs control（CTRL）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs KP group.圖2 KP感染阻斷大鼠CD4+T細(xì)胞活化

3 KP感染促進(jìn)Myc、HIF-1α和mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

獨(dú)創(chuàng)性路徑分析預(yù)測了KP 參與上調(diào)T 細(xì)胞激活的關(guān)鍵信號通路，其中包括Myc、HIF-1α 和mTOR通路，見圖3A。據(jù)此，基因表達(dá)分析證實(shí)，KP感染在體外促進(jìn)了CD4+T 細(xì)胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所調(diào)節(jié)的基因的上調(diào)，見圖3B。由于HIF-1α、Myc 和mTORC1 是T 細(xì)胞有氧糖酵解和Warburg 樣代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［7］，進(jìn)一步RNA序列分析結(jié)果表明，KP感染處理顯著促進(jìn)了激活后T 細(xì)胞中幾種糖酵解基因的上調(diào)，見圖3C。

Figure 3. KP infection promoted HIF-1α，Myc and mTORC1 signaling transduction. A：original pathway analysis predicted that KP up-regulated Myc，HIF-1α and mTOR regulatory pathways；B：the thermography showed the expression of the genes regulated by Myc，HIF-1α and mTOR in T cells activated by DMSO（Th0 CTRL）or KP（Th0 KP）；C：the thermography showed the expression of glycolytic genes in Th0 CTRL and Th0 KP cells.圖3 KP感染促進(jìn)了HIF1-α、Myc和mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

4 PK感染促進(jìn)Th17和Th1細(xì)胞的發(fā)育

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對照組相比，KP 感染后Th17 細(xì)胞和Th1 細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.01），加入GIMAP5 重組蛋白可阻斷Th17 和Th1 細(xì)胞的發(fā)育，見圖4A、B。重要的是，本研究還觀察到KP 感染耗盡Treg 群體（P＜0.01），加入GIMAP5 重組蛋白可誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生（P＜0.01），見圖4C。

Figure 4. Flow cytometry was used to evaluate the percentages of Th17+ cells（A），Th1 cells（B），and Treg（C）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CTRL group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs KP group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)測定Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞和Treg的比例

討 論

KP 因其可引起廣泛感染及高水平抗生素耐藥性而備受關(guān)注［8］。作為對KP 感染的反應(yīng)，宿主會觸發(fā)強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括肺固有層CD3+CD4+T 細(xì)胞增多和T 細(xì)胞浸潤。小鼠肺部KP 感染是最早證明IL-17A對宿主細(xì)胞防御外細(xì)菌感染重要性的傳染病模型之一［9］。近年來，研究顯示KP 感染的CD4+T細(xì)胞在抗原刺激下表現(xiàn)出生存受損和DNA損傷增加［10］。GIMAP5蛋白主要在淋巴細(xì)胞中表達(dá)，并在發(fā)育、選擇和穩(wěn)態(tài)過程中調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞存活［11］。然而，目前關(guān)于KP 感染是否通過調(diào)節(jié)GIMAP5 的活性來控制T細(xì)胞活化卻從未被研究過，尤其是在T細(xì)胞亞群的背景下。本研究顯示GIMAP5在CD3/CD28刺激后表達(dá)上調(diào)，并積聚在CD4+T 細(xì)胞中；KP 感染顯著降低了GIMAP5 表達(dá)，嚴(yán)重影響T 細(xì)胞活化，并促進(jìn)了促炎性Th17和Th1細(xì)胞的體外發(fā)育。

GIMAP5可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到增殖細(xì)胞的細(xì)胞核，發(fā)揮不同的功能，如組蛋白磷酸化和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括調(diào)控Myc轉(zhuǎn)錄和與HIF-1α相互作用以促進(jìn)HIF-1α依賴基因的表達(dá)，編碼參與糖酵解的酶［4］。GIMAP5 也被證明通過mTORC1抑制富含脯氨酸的AKT1底物1的磷酸化或通過減少絲氨酸的合成來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中mTORC1的活性，且GIMAP5可在增殖細(xì)胞中維持mTORC1 功能［12］。本研究結(jié)果表明，GIMAP5 的活性可能通過控制HIF-1α、mTORC1 和Myc 的功能，以及T 細(xì)胞受體激活的CD4+T 細(xì)胞中有氧糖酵解的參與而調(diào)控，這些是其激活的關(guān)鍵因素［7］。值得注意的是，靜息T細(xì)胞細(xì)胞核中GIMAP5的水平較低，先前的研究表明HIF-1α和Myc的活性可能由mTORC1自身控制［13］。因此，抑制GIMAP5的活性可以阻斷HIF-1α和Myc在CD3/CD28刺激下的高表達(dá)水平。這些結(jié)果可以解釋KP 體外感染促進(jìn)了CD4+T 細(xì)胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所誘導(dǎo)的基因的上調(diào)。因此，KP 感染可能對T細(xì)胞代謝有更廣泛的影響。

本研究還表明，KP 感染誘導(dǎo)促炎性Th17 和Th1細(xì)胞的發(fā)育，且抑制Treg 生成，從而抑制體內(nèi)自身免疫。先前的研究表明，誘導(dǎo)mTORC1、Myc 和HIF-1α可以抑制炎癥條件下Foxp3+T細(xì)胞的發(fā)育［14-15］。其他研究表明，糖酵解和mTORC1/HIF-1α 活性抑制有利于Treg 的生成［16］。而抑制有氧糖酵解可限制小鼠模型和人類疾病中T 細(xì)胞介導(dǎo)的Th17 生成和發(fā)展［17］。鑒于本研究結(jié)果表明KP在體外可阻斷TGF-β誘導(dǎo)的Treg，因此需要進(jìn)一步研究GIMAP5 在Treg 生成和功能中的重要性。此外，為了進(jìn)一步確認(rèn)GIMAP5在介導(dǎo)KP 感染引起的T 細(xì)胞激活和致病性中的作用，應(yīng)進(jìn)一步在體內(nèi)模型中分析GIMAP5基因缺失對KP感染大鼠T細(xì)胞功能的影響。

綜上所述，影響GIMAP5 活性可能是限制KP 感染誘導(dǎo)T 細(xì)胞致病性的一個(gè)潛在途徑。本研究支持這樣一種觀點(diǎn)，即通過上調(diào)T細(xì)胞中GIMAP5的表達(dá)來限制Th1/Th17 的發(fā)育是治療KP 感染的一種有價(jià)值的方法。