楊勇幫 李健田 白 玥

1.云南省玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 玉溪 653100；2.普洱學(xué)院，云南 普洱 665000

民族民間用藥是中華傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，其歷史悠久并具很強(qiáng)的地域性。黑骨頭為云南省哈尼族、彝族常用藥材[1]，別名有鐵骨頭、牛尾蕨、青蛇膽、黑龍骨、青風(fēng)藤等。主要用于腰痛、風(fēng)濕麻木、跌打損傷及蛇咬傷的治療。黑骨頭最早是《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》(1974)[2]収載品種，現(xiàn)為《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版)[3]収載品種；其植物來(lái)源為蘿藦科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.及青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥老莖和根?！对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》(2005年版)黑骨頭藥材標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下初步制訂了名稱、來(lái)源、性狀、薄層鑒別、檢查(水分、總灰分)、浸出物等項(xiàng)目，但沒(méi)有對(duì)其指標(biāo)成分進(jìn)行定性和含量測(cè)定；難以控制藥材的質(zhì)量，無(wú)法保證臨床用藥的安全性和有效性。因此完善和提高黑骨頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得非常有必要。

現(xiàn)代對(duì)黑骨頭藥材的研究，更多的是對(duì)植物黑龍骨的成分研究[4-6]；而對(duì)植物青蛇藤的研究非常少見(jiàn)，僅見(jiàn)《青蛇藤化學(xué)成分研究》《青蛇藤正丁醇部分苷類成分的分離與鑒定》等文獻(xiàn)?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，黑骨頭的研究多集中在化學(xué)成分、總皂苷、總黃酮及槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量測(cè)定和藥理作用等方面，未見(jiàn)關(guān)于黑骨頭和杠柳毒苷定性鑒別及含量測(cè)定方法的研究報(bào)道[7]。對(duì)于黑骨頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，特別是采用HPLC方法測(cè)定青蛇藤中杠柳毒苷的含量研究，目前尚無(wú)相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)確定以強(qiáng)心苷類具有促進(jìn)傷口愈合作用的杠柳毒苷作為控制指標(biāo)，對(duì)黑骨頭藥材中杠柳毒苷成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其方法進(jìn)行驗(yàn)證，以便能更全面地分析評(píng)價(jià)其藥材質(zhì)量和安全性。為民族藥黑骨頭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考，同時(shí)也為黑骨頭藥材及相關(guān)制劑進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME403E 103型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、CPX5800H-C型超聲清洗儀(必能信超聲(上海)有限公司)、BP211D型電子天平(賽多利斯)、DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱(上海合恒儀器有限公司)、1260 Infinity型高效液相色譜儀(安捷倫科技)、粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)、MS204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、Cavy 60 UV-Vis型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(安捷倫科技)、DESA6A薄層色譜板成像儀。

1.2 材料 杠柳毒苷對(duì)照品(純度：98%，CAS No.13137-64-9，成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司)純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，三氯甲烷、丙酮、甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇均為四川西隴科學(xué)有限公司，30%乙醇、45%乙醇、70%乙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用，均用無(wú)水乙醇和純凈水配制)，乙腈(色譜純，四川西隴科學(xué)有限公司)，所用試劑除乙腈外均為分析純，并且均在有效期內(nèi)。

云南地產(chǎn)藥材黑骨頭，經(jīng)玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所副主任中藥師牟娟鑒定為蘿藦科植物青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥莖切片。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液的制備 供試品制備：將黑骨頭樣品粉碎成粗粉，過(guò)2號(hào)篩，取藥材粉末約2 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，將濾液過(guò)濾后放在恒溫水浴鍋上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。對(duì)照品溶液制備：取杠柳毒苷對(duì)照品適量，加入甲醇溶解制成1 mg/mL溶液，作為對(duì)照品試液。

樣品 對(duì)照品

樣品 對(duì)照品

2.1.2 薄層色譜 鑒別照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部[8])試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液10 μL，杠柳毒苷對(duì)照品溶液20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，將薄層板置于展開(kāi)缸中預(yù)飽和15 min，以三氯甲烷：丙酮：水(10∶3∶1)為展開(kāi)劑上行展開(kāi)，展開(kāi)，取出，揮干溶劑，噴以5%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別又置于紫外光燈(365 nm)下視檢。供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)?？梢猿醪酱_定黑骨頭藥材中含有杠柳毒苷。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 杠柳毒苷含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1所示流動(dòng)相洗脫程序；柱溫25 ℃：檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速 1 mL/min。對(duì)照品及供試品色譜圖如圖3、圖4所示。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

圖3 對(duì)照品圖譜

圖4 樣品圖譜

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取杠柳毒苷對(duì)照品適量，精密稱定，加45%乙醇溶液制成每1 mL含0.207 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取黑骨頭粉末約2 g，置于錐形瓶中，精密量取45%乙醇25 mL加入至錐形瓶，稱定重量。置于超聲提取30 min，再次稱重，補(bǔ)足減失的重量后過(guò)濾，取續(xù)濾液作供試品溶液備用。

2.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 將制備好的對(duì)照品溶液取適量置于比色皿中，放入Cavy 60 UV-Vis型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最終確定杠柳毒苷最大吸收波長(zhǎng)為220 nm。

2.2.5 線性關(guān)系的考察 稱取杠柳毒苷對(duì)照品10.57 mg至50 mL容量瓶中，加入45%乙醇溶液至刻度，即得到濃度為0.207 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取杠柳毒苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液25 mL至 100 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液。取1 mL濃度為 0.052 mg/mL 杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0052 mg/mL杠柳毒苷溶液；取2 mL濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.0104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；取5 mL濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶45%乙醇溶液至刻度，得到0.026 mg/mL杠柳毒苷溶液；取5 mL濃度為0.207 mg/mL杠柳毒苷溶液至 10 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；再取0.052、0.207 mg/mL 的對(duì)照品溶液，共計(jì)6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，按色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B按表1所示流動(dòng)相洗脫程序；柱溫25 ℃：檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)行高效液相色譜分析，以進(jìn)樣濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=6225X+0.2665,R2=0.9999，在0.005 mg/mL～0.207 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液按“2.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果杠柳毒苷峰面積RSD值為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定峰面積，計(jì)算含量得平均含量為0.5717 mg/g，RSD值為1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在室溫0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h的時(shí)間下按“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定峰面積，RSD值為0.59%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量(0.5717 mg/g)的供試品6份至不同的錐形瓶中，精密加入杠柳毒苷對(duì)照品溶液(0.207 mg/mL)3 mL ，照供試品溶液的制備方法制備。取上述6份供試品溶液分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積并計(jì)算含量。根據(jù)(《中國(guó)藥典》2015版四部)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則準(zhǔn)確度計(jì)算方法(用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量)，即計(jì)算加樣回收率=(實(shí)測(cè)含量-所取樣品含量)/加入對(duì)照品量×100%)及RSD值。結(jié)果：平均回收率為99.1%，RSD為0.94%，表明該HPLC檢測(cè)條件、方法的可靠性強(qiáng)。如表2所示。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.2.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，分別取2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣。按色譜條件進(jìn)行測(cè)定峰面積，計(jì)算含量結(jié)果見(jiàn)表3所示。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

通過(guò)按本試驗(yàn)方法條件進(jìn)樣考察，表明線性關(guān)系良好、儀器精密度良好、方法重復(fù)性良好、供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，本方法所測(cè)的黑骨頭藥材樣品中的杠柳毒苷含量為0.5717mg/g(0.057%)，根據(jù)(《中國(guó)藥典》2015版四部)中對(duì)高效液相色譜法回收率的要求，其在85%～90%至108～110%之間均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。本次加樣回收試驗(yàn)杠柳毒苷的回收率為99.1%，在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定允許范圍內(nèi)。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，對(duì)今后黑骨頭藥材的質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)考察，采用不同的柱溫分別觀察色譜柱的分離能力，最終確定柱溫25℃分離度最好。以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，不同梯度洗脫程序進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定洗脫程序。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，最終確定使用C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離效果好、達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

通過(guò)對(duì)黑骨頭藥材的初步研究，發(fā)現(xiàn)云南習(xí)用的黑骨頭藥材來(lái)源大多是蘿藦科植物青蛇藤的干燥老莖。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)及采用薄層色譜鑒別方法，并與杠柳毒苷對(duì)照物質(zhì)的比較，初步確定了藥材青蛇藤中含有杠柳毒苷，為后續(xù)采用高效液相色譜法測(cè)定杠柳毒苷含量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為完善及提高黑骨頭藥材標(biāo)準(zhǔn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。