胡世一 周雅琴,2* 安 寧 石忠衡 趙立春 譚小明，3*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)中心，廣西 南寧 530200

人體在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，如過氧化自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等，它們是人體疾病、衰老和死亡的直接參與者，一般情況下，當(dāng)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除能力處于平衡狀態(tài)時(shí)，受控的自由基對人體是有益的，一旦失衡，體內(nèi)就會出現(xiàn)“氧化應(yīng)激”狀態(tài)，這時(shí)則需要通過補(bǔ)充抗氧化劑來調(diào)整體內(nèi)自由基平衡，以防止疾病的發(fā)生[1]。日常中，被廣泛應(yīng)用于化妝品、保健食品和藥物中的抗氧化劑多為人工化學(xué)合成制品，存在有諸多毒副作用，難以滿足人們的生活需求[2]。

內(nèi)生真菌是指生活在健康植物組織器官內(nèi)部，但不會引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類真菌，包括一些在其生活史的某一階段表面生的腐生菌、潛伏性病原菌和菌根菌[3]。人們對內(nèi)生真菌的研究始于1993年，美國科學(xué)家Stierle首次從太平洋短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)韌皮部中獲得1株能夠生產(chǎn)抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae[4]。近年來的研究[5]顯示，內(nèi)生真菌能提高宿主植物對非生物脅迫與生物脅迫的抗逆性，部分內(nèi)生真菌能自身產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的活性成分物質(zhì)。因此，從植物中分離和篩選出具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌，對食品、醫(yī)藥等工業(yè)具有重要意義。

青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.系胡桃科青錢柳屬植物，又名青錢李、山麻柳、山化樹、一串錢、山麻柳、甜茶樹等，為我國特有的單種屬珍稀植物，有植物界大熊貓和醫(yī)學(xué)界的“第三顆樹”以及“天然胰島素”的美譽(yù)，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛功效，可用于頑癬，集綠化、保健、藥用、材用于一體[6]。研究[7]表明，青錢柳組織中含有黃酮類、酚類、萜類等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗菌及抗腫瘤等活性作用。青錢柳不同溶劑提取物對DPPH、超氧、羥自由基均具有不同強(qiáng)度的清除能力[8]，青錢柳葉70 %乙醇提取物具有較好的抗氧化活性，一些成分的體外抗氧化活性強(qiáng)于VC[9]。但是，現(xiàn)階段國內(nèi)外有關(guān)青錢柳內(nèi)生真菌的研究報(bào)道尚少。研究以青錢柳內(nèi)生真菌為研究對象，篩選出活性較高的菌株并加以分類鑒定，旨在為尋找新型天然抗氧化劑提供可利用的候選菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料植物 材料于2019年4月采自廣西百色市樂業(yè)縣雅長鄉(xiāng)(E 106°20′；N 24°84′)，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)譚小明研究員鑒定為青錢柳C.paliurus。131株內(nèi)生真菌分別從青錢柳的根、莖皮等組織中分離獲得。以上材料采保藏于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液制備 在無菌超凈工作臺上，采用PDA平板培養(yǎng)基活化真菌7 d，然后用接種針挑取3個(gè)菌塊(直徑為6 mm)，接種到含 100 mL PDA液體培養(yǎng)基錐形瓶(250 mL)中，在轉(zhuǎn)速為 120 r/min 的搖床上震蕩暗培養(yǎng)10 d(培養(yǎng)溫度為 25 ℃)。發(fā)酵液用4層無菌的干凈紗布過濾。將濾液于 10，000 r/min 條件下離心 10 min，取上清液于 45 ℃，8×103Pa 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，稱重，加無菌去離子水配成 10 mg/mL 的樣品溶液，保存于 4 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 DPPH自由基清除率測定 DPPH法快速、簡便、重現(xiàn)性好，自由基DPPH·在有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)中非常穩(wěn)定，顯紫色，在 517 nm 波長處有強(qiáng)吸收，DPPH溶液與自由基清除劑混合時(shí)，顏色由紫色變成淺黃色。參考文獻(xiàn)的方法[12]，以Vc作陽性對照，檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·自由基清除能力。清除率的計(jì)算公式如：DPPH清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100，式中：A0為空白對照OD值，Ai為樣品或陽性對照DPPH溶液的OD值。

1.2.3 羥基(·OH-)自由基清除能力測定 OH是毒性最大的活性氧自由基，會引起脂質(zhì)過氧化作用及造成人體損傷。利用Fenton反應(yīng)體系法[12]，以Vc作陽性對照，在 510 nm 處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除·OH-的能力，清除率的計(jì)算公式同1.2.2。

1.2.4 亞鐵離子(Fe2+)螯合能力測定 鐵具有高反應(yīng)活性，能促使機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，對亞鐵離子的螯合，可以減少氧化損傷。采用Ferrozine(菲啰嗪)比色法[12]，以EDTA-2Na作陽性對照，在 562 nm 處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對亞鐵離子的螯合能力，對亞鐵的螯合率計(jì)算公式如：Fe2+螯合能力清除率(%)=[(A0-Ai)/A0] × 100，式中：A0為空白對照的OD值，Ai為加有樣品或陽性對照后的OD值。

通過1.2.1-1.2.4方法，綜合篩選出18株活性較好的菌株，作為深入研究對象，進(jìn)行以下2種抗氧化活性指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2019和DPS 7.05 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行單因素方差分析。不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異性極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用 通過DPPH自由基清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有35株真菌發(fā)酵液清除率高于50%(見表1)，占總供試菌株的25%。其中清除率低于60%高于50%的菌株有10株，編號894F和851F的清除能力最低，均為50.12%；清除率低于70%高于60%的菌株有17株，大于70 %共8株，清除率介于70%～80%之間的菌株有7株，編號分別為913J、885J、892J、909F、882F、937F、820F；清除率高于80%菌株僅1株，編號為937J，為81.32%，131株內(nèi)生真菌清除DPPH能力均小于VC的清除率85.90%。

表1 青錢柳內(nèi)生真菌DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

2.2 青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對·OH-自由基清除作用 共有103株真菌的·OH-清除能力大于50%，占總供試菌株的77%(見表2)。其中清除率在50%至60%的菌株有17株，編號為903J清除率最低，為50.00%；清除率介于60%～70%、70%～80%之間的菌株分別有25株、29株；清除率高于80%低于90%的菌株有32株，其中，共有7株清除率高于陽性對照VC清除率85.83%，編號為824F、894F、907F、885F、890F、912F、876F；菌株912F和876F的清除能力最強(qiáng)，清除率分別為 87.83%、87.74%。

表2 青錢柳內(nèi)生真菌·OH-自由基清除能力測定結(jié)果

續(xù)表2

2.3 青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對Fe2+螯合能力 共計(jì)88株內(nèi)生真菌的Fe2+螯合能力高于50%，占總供試菌的67%(見表3)。清除率大于50%小于60%的菌株有38株，編號930F清除能力最低，為50.14%；清除率在60%至70%之間的菌株36株，清除率高于70%低于80%的菌株有12株，編號為911F、926F、851F、929F、808F、820F、810F、850F、845F、823F、912F、898F；清除率高于80%共有2株，編號為907F、840F，清除率均為82.24%，均低于陽性對照EDTA-2Na清除率85.07%。

表3 青錢柳內(nèi)生真菌Fe2+螯合能力測定結(jié)果

3 討論

內(nèi)生真菌的生物活性取決于其代謝產(chǎn)物所含的功能性成分。文獻(xiàn)研究表明，目前國內(nèi)外對青錢柳內(nèi)生真菌抗氧化和抗菌活性方面的研究報(bào)道較少，僅有寇曉琳等[12]對青錢柳內(nèi)生真菌的抗菌活性進(jìn)行研究，研究結(jié)果從67株內(nèi)生真菌中篩選出7株菌株具有穩(wěn)定產(chǎn)生黃酮類化合物的能力，進(jìn)一步的抗菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中具有較強(qiáng)的抑菌活性作用。相近屬種的其他植物如野核桃[13]和核桃[14]則開展了內(nèi)生真菌的抗菌和抗氧活性的研究?？梢?，胡桃科植物內(nèi)生真菌蘊(yùn)藏有抗菌、抗氧化等多種代謝活性物質(zhì)，這同植物與宿主的“共生理論”達(dá)成一致，也說明胡桃科植物內(nèi)生真菌是尋找高抗氧化活性物質(zhì)的可選資源。